荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

摘要

来源：Nolan, R., 等 无需校准 体外 使用商用仪器和免费开源亮度分析软件定量检测蛋白质同源寡聚化 视频实验杂志 (2018)

本视频展示了利用荧光涨落光谱法（FFS）研究蛋白质同源寡聚化的技术。在使用FFS研究蛋白质寡聚化时，样品中带有荧光标记的蛋白质会通过某种试剂诱导形成二聚体。利用共聚焦显微镜，当蛋白质分子进出微小的观测体积时，通过分析荧光分子亮度涨落的变化，可确定蛋白质的寡聚状态。

方案

1. FKBP12 F36V -mVenus 纯化

1. 将含有单体化人源 FKBP12F36V12 及 N 端 His6 和 mVenus 标签的 pET22b 载体（载体可应要求提供）转化至 BL21(DE3) pLysS 感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于添加 50 µg/mL 氨苄青霉素和 34 µg/mL 氯霉素的 LB 琼脂平板上。
2. 将转化后的菌落转移至100 mL LB起始培养液中，于37 °C振荡培养16–20小时。
3. 稀释浓稠的起始培养物（OD600 >1) 在LB培养基中按1:100比例接种（2份，每份500 mL），于37 °C、200 rpm条件下振荡培养2–3小时，至OD600达到0.6–0.8。
4. 将培养物置于冰上冷却。加入250 µM IPTG进行诱导，在21 °C、200 rpm条件下培养16–20小时。
5. 通过离心在 2,000 x g 条件下收集细胞 g 20 分钟。
6. 将沉淀重悬于40 mL IMAC缓冲液A（20 mM 磷酸钠 pH 7.5，500 mM NaCl，3 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）中，加入无EDTA蛋白酶抑制剂（每细胞沉淀加1片）。
7. 将细胞在冰上进行超声处理（500 瓦，20 kHz，40% 振幅，工作 9 秒，间歇 11 秒，持续 15 分钟），然后在 20,000 × g 离心收集可溶性组分 <....

结果

图 1. 应用 N&B 方法检测溶液中蛋白质单体-二聚体转变。（a） 激光扫描显微镜（LSM）的简化光路图，配备激光光源（对于标记 mVenus 的蛋白质，设定为 514 nm），激光经由蓝色箭头所示路径导向浸油物镜（本实验中为 63×1.4NA 油镜），照射含有 100 nM FKBP12F36V-mVenus 溶液的样品。发射的荧光（绿色箭头）穿过二向色镜，经带通滤光片净化后，通过设置为 1 阿里单位的针孔，最终到达具备光子计数能力的点式数字探测器。（b） 共聚焦照明体积以 16×16 像素进行扫描，单个 FKBP12F36V-mVenus 分子进入和离开呈高斯形状的共聚焦体积，产生一系列荧光强度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RosettaTM (DE3) pLysS 细胞	Novagen	70956-3
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329824407
氯霉素	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID: 24892250
LB 起始培养物	QIAGEN
LB 培养基	QIAGEN	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329815691
IMAC 缓冲液	Medicago	09-1010-10
无 EDTA 蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	11873580001
TALON 树脂	Clonetech
镍琼脂糖凝胶	GE Healthcare
S200 16/60 柱	GE Healthcare
玻璃底 8 孔观察皿	Ibidi	80827