荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

摘要

来源：Nolan, R., 等 无需校准 体外 使用商用仪器和免费开源亮度分析软件定量检测蛋白质同源寡聚化 视频实验杂志 (2018)

本视频展示了利用荧光涨落光谱法（FFS）研究蛋白质同源寡聚化的技术。在使用FFS研究蛋白质寡聚化时，样品中带有荧光标记的蛋白质会通过某种试剂诱导形成二聚体。利用共聚焦显微镜，当蛋白质分子进出微小的观测体积时，通过分析荧光分子亮度涨落的变化，可确定蛋白质的寡聚状态。

方案

1. FKBP12 F36V -mVenus 纯化

1. 将含有单体化人源 FKBP12F36V12 及 N 端 His6 和 mVenus 标签的 pET22b 载体（载体可应要求提供）转化至 BL21(DE3) pLysS 感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于添加 50 µg/mL 氨苄青霉素和 34 µg/mL 氯霉素的 LB 琼脂平板上。
2. 将转化后的菌落转移至100 mL LB起始培养液中，于37 °C振荡培养16–20小时。
3. 稀释浓稠的起始培养物（OD600 >1) 在LB培养基中按1:100比例接种（2份，每份500 mL），于37 °C、200 rpm条件下振荡培养2–3小时，至OD600达到0.6–0.8。
4. 将培养物置于冰上冷却。加入250 µM IPTG进行诱导，在21 °C、200 rpm条件下培养16–20小时。
5. 通过离心在 2,000 x g 条件下收集细胞 g 20 分钟。
6. 将沉淀重悬于40 mL IMAC缓冲液A（20 mM 磷酸钠 pH 7.5，500 mM NaCl，3 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）中，加入无EDTA蛋白酶抑制剂（每细胞沉淀加1片）。
7. 将细胞在冰上进行超声处理（500 瓦，20 kHz，40% 振幅，工作 9 秒，间歇 11 秒，持续 15 分钟），然后在 20,000 × g 离心收集可溶性组分 g.
8. 将可溶性裂解液转移至锥形瓶中，并加入2 mL树脂（参见 材料清单）。在105 rpm转速下旋转孵育1小时
   注意： 镍-Sepharose也可用于此IMAC步骤。
9. 收集树脂，先用250 mL IMAC缓冲液A洗涤，再用500 mL IMAC缓冲液B（20 mM 磷酸钠 pH 7.5，500 mM NaCl，7 mM 咪唑，1 mM β-巯基乙醇）洗涤。
   注意： 若使用镍-Sepharose树脂，则将咪唑浓度提高至50 mM。
10. 使用IMAC缓冲液C（20 mM磷酸钠pH 7.5，500 mM NaCl，300 mM咪唑，1 mM β-巯基乙醇）洗脱His6标签蛋白。
11. 注入尺寸排阻柱中（参见 材料表) 在含10 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl和1 mM DTT的缓冲液中进行平衡。FKBP12F36V 在我们所用的层析柱上洗脱峰位于87.71 mL。
12. 评估纯度 通过 SDS-PAGE 电泳，并根据需要合并和浓缩样品。

2. 多孔板阵列的制备

1. 从 -80 °C 中解冻纯化的 FKBP12F36V（或目标标记蛋白）。
2. 配制含有 100 nM 纯化 FKBP12F36V 的溶液（缓冲液成分为 10 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM DTT）。进行超声处理并离心（快速离心 13,000 rpm），以防止形成聚集体。
3. 将 100 - 200 µL 溶液移入底部为玻璃的 8 孔观察室中。
4. 加入 BB 二聚化分子，使其终浓度分别为 10、20、40、80、100、150、300 和 500 nM。
5. 作为对照，配制仅含 100 nM mVenus 的溶液，用于评估潜在的聚集和沉淀效应，并在相同采集条件下获得单体的亮度值。

3. 无需校准的共聚焦采集

1. 启动共聚焦显微系统（图1任何配备数字探测器或性能明确的模拟探测器，并能够对所获取的每个像素保持恒定驻留时间的共聚焦激光扫描显微系统均可使用。
2. 设置激发光路：
   1. 打开514 nm激光器，并将物镜出口处的输出功率设置为20 - 100 nW（适用于FKBP12F36V-mVenus）。
   2. 选择63X1.4NA物镜，或专为FCS设计的带校正环的水浸物镜。
   3. 打开一个 HyD、APD 或校准的 PMT 检测器。优先选择能够进行光子计数的检测器，因为在这种情况下，可以计算 S，偏移量和σ₀² 是不必要的。
   4. 选择520 - 560 nm的发射波长窗口
   5. 将针孔设为对应发射波长约 545 nm 的 1 个艾里单位。
   6. 将采集模式设置为 16 × 16 像素
   7. 设置像素驻留时间 t_停留 以满足 t_帧 >> T_D >> t_停留，其中 T_D 是扩散蛋白的停留时间 t_帧 是帧率，这相当于将停留时间设置为约 13 µs。
      注意： 一些商业制造商的扫描仪未能保持每个像素的停留时间恒定。这种恒定性对于该方法的正常运行至关重要。
   8. 将像素大小设置为约 120 nm。
   9. 选择 xyt 采集模式，并选择每次采集每个孔所需的帧数（例如 5,000）。
   10. 如果系统配备高通量模式，可输入每个孔的坐标以及每孔采集次数，以实现流程自动化。
       注意： 使用浸没物镜时，务必确保配有水分配器。
   11. 如果系统配备了灌注装置，请加载 BB 溶液并设置灌注程序，使其在5000后立即开始^th 评估二聚化动力学的同时进行采集的框架 例如， 10,000 张图像。
3. 若使用专为FCS设计的带校正环的水浸物镜，请向油浸物镜/水中加入一滴油。
4. 将8孔观察室安装到载物台上。
5. 选择正确的孔并聚焦于溶液。
   注意： 重要提示：避免在靠近底部玻璃处聚焦，以防反射和散射。当需要对溶液更深处进行聚焦时，应断开自动聚焦选项。
6. 开始采集并将生成的图像序列以TIFF格式保存。

4. 使用 R 软件包 nandb 进行去趋势和亮度分析

1. 作为预处理的质量检查，使用 ImageJ 查看图像并获取强度分布图，如图 2a所示。这有助于判断是否发生了过度的光漂白。如果漂白过于严重，则数据不适合进一步分析。
   注意：ImageJ 还可用于将图像从商业格式转换为 TIFF 格式。下文所述的 nandb 软件仅支持 TIFF 文件。
2. 下载并安装 R 和 RStudio。建议先下载并安装 R，然后再安装 RStudio。
   注意：以下内容描述了如何使用 nandb R 软件包。使用 nandb 并不需要掌握 R 语言，但了解 R 语言将使操作更加便捷。
3. 安装 nandb 软件包。
   1. 打开 RStudio，在控制台中输入 install.packages("nandb")，然后等待安装完成。
4. 熟悉 nandb
   1. 查阅用户手册。
   2. 查看 RStudio 内置的帮助文档以了解各个函数。最常用的函数是 brightness()。在控制台中输入 ? brightness() 即可查看该函数的帮助文件。
5. 计算亮度
   1. 假设桌面上有一个名为 img001.tif 的图像文件（注意：`nandb` 仅支持 TIFF 文件）。可以计算该图像的亮度：
      b <- brightness("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. 此命令将图像的亮度值赋给 R 中的变量 b。tau = "auto" 可确保在计算亮度前对图像进行正确的去趋势处理。接下来最常见的操作是计算图像的平均亮度或中位数亮度，可通过输入 mean(b) 或 median(b) 实现。也可以将亮度图像保存到桌面，方法如下：
         ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. 假设桌面上有一个名为 images_folder 的文件夹，其中包含多个图像文件，需要计算这些图像的亮度，并将亮度图像以 TIFF 格式保存。此时可查看 ?brightness_folder() 的帮助文档。该函数可一次性处理整个文件夹：
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      对于偏好使用其他软件而非 R 的用户，此功能尤为便利，因为所有文件可通过单条命令完成处理，之后即可在所选软件（如 ImageJ、Python 或其他工具）中继续分析输出的亮度 TIFF 图像。

结果

图 1. 应用 N&B 方法检测溶液中蛋白质单体-二聚体转变。（a） 激光扫描显微镜（LSM）的简化光路图，配备激光光源（对于标记 mVenus 的蛋白质，设定为 514 nm），激光经由蓝色箭头所示路径导向浸油物镜（本实验中为 63×1.4NA 油镜），照射含有 100 nM FKBP12F36V-mVenus 溶液的样品。发射的荧光（绿色箭头）穿过二向色镜，经带通滤光片净化后，通过设置为 1 阿里单位的针孔，最终到达具备光子计数能力的点式数字探测器。（b） 共聚焦照明体积以 16×16 像素进行扫描，单个 FKBP12F36V-mVenus 分子进入和离开呈高斯形状的共聚焦体积，产生一系列荧光强度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RosettaTM (DE3) pLysS 细胞	Novagen	70956-3
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329824407
氯霉素	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID: 24892250
LB 起始培养物	QIAGEN
LB 培养基	QIAGEN	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Substance ID 329815691
IMAC 缓冲液	Medicago	09-1010-10
无 EDTA 蛋白酶抑制剂	Sigma Aldrich	11873580001
TALON 树脂	Clonetech
镍琼脂糖凝胶	GE Healthcare
S200 16/60 柱	GE Healthcare
玻璃底 8 孔观察皿	Ibidi	80827