荧光波动光谱研究蛋白质同源寡聚化

1. FKBP12 F36V -mVenus 纯化

1. 使用含有单体化人 FKBP12F36V12 和 N 端 His6 和 mVenus 标签（可根据要求提供载体）的 pET22b 载体转化 （DE3） pLysS 细胞。将细胞接种到补充有 50 μg/mL 氨苄青霉素和 34 μg/mL 氯霉素的 LB 琼脂上。
2. 将转化的菌落转移到 100 mL LB 发酵剂中，并在 37 °C 下振荡生长 16 - 20 小时。
3. 在 LB 培养基（2 x 500 mL 批次）中以 1:100 稀释致密发酵剂培养物 （OD600 >1） 并生长 2 - 3 小时至 OD600 = 0.6 - 0.8（37 °C，200 rpm）。
4. 在冰上冷却培养物。用 250 μM IPTG 诱导，并在 21 °C、200 rpm 下生长 16 - 20 小时。
5. 以 2,000 x g 离心 20 分钟，收获细胞。
将
6. 沉淀重悬于 40 mL IMAC 缓冲液 A（20 mM 磷酸钠 pH 7.5、500 mM NaCl、3 mM 咪唑、1 mM β-巯基乙醇）中，补充有不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂（每个细胞沉淀 1 片）。
7. 在冰上对细胞（500 瓦，20 kHz，40% 振幅，9 秒开，11 秒关，15 分钟）进行超声处理，并通过以 20,000 x g 离心收获可溶性物质。
8. 将可溶性裂解物转移到锥形瓶中，并加入 2 mL 树脂（参见材料表）。以 105 rpm 转速孵育 1 小时
   注意:琼脂糖凝胶镍也可用于此 IMAC 步骤。
9. 收获树脂并用 250 mL IMAC 缓冲液 A 洗涤，然后用 500 mL IMAC 缓冲液 B（20 mM 磷酸钠 pH 7.5、500 mM NaCl、7 mM 咪唑、1 mM β-巯基乙醇）洗涤><。 注意: 如果使用镍琼脂糖凝胶树脂，则增加至 50 mM 咪唑。
10. 使用 IMAC 缓冲液 C（20 mM 磷酸钠 pH 7.5、500 mM NaCl、300 mM 咪唑、1 mM β-巯基乙醇）洗脱 His 6 标记的蛋白质。
11. 进样到在 10 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl 和 1 mM DTT 中平衡的体积排阻柱（参见材料表）上。FKBP12F36V在我们使用的色谱柱上的洗脱峰为 87.71 mL。
12. 通过 SDS-PAGE 评估纯度，并根据需要混合和浓缩。

2. 多孔板阵列的制备

1. 将纯化的FKBP12F36V（或标记的目标蛋白质）从-80°C解冻。
2. 制备 100 nM 纯化FKBP12F36V溶液（培养基，10 mM HEPES pH 7.5,150 mM NaCl，1 mM DTT）。超声处理并离心（13,000 rpm 的快速旋转）以防止形成聚集体。
3. 将 100 - 200 μL 移液至带玻璃底的 8 孔观察室中。
4. 添加 BB 二聚体至终浓度为 10、20、40、80、100、150、300 和 500 nM。
5. 作为参考，制备单独的 100 nM mVenus 溶液，以评估潜在的聚集和沉淀效应，并使用相同的采集设置恢复单体的亮度值。

3. 免校准共聚焦采集

1. 启动共聚焦系统（图 1）。任何配备数字探测器或特性明确的模拟探测器的光学扫描显微镜共聚焦系统，并且能够为采集的每个像素保持恒定的停留时间，都可以工作。
2. 设置激发光束路径:
   1. 打开 514 nm 激光器，并在物镜出口处将其设置为 20 - 100 nW 功率（对于 FKBP12F36V-mVenus）。
   2. 选择 63X1.4NA 物镜或专为 FCS 设计的环校正水浸物镜。
   3. 打开一个 HyD、APD 或校准的 PMT 探测器。能够进行光子计数的探测器是可取的，因为在这种情况下，不需要计算 S、偏移量和σ₀²。
   4. 从 520 - 560 nm 中选择发射窗口
   5. 将针孔设置为 1 Airy 单位，用于相应的发射 ~545 nm。
   6. 将采集模式设置为 16 x 16 像素
   7. 设置像素驻留时间 t_驻留，使其满足 T _D >> t_驻留>> t_帧，其中 T_D 是扩散蛋白的驻留时间，t_帧是帧速率。这相当于将驻留时间设置为 ~13 μs。
      注意:一些商业制造商的扫描仪无法保持每个像素的停留时间不变。这种恒定性对于该方法的运作至关重要。
   8. 将像素大小设置为 ~120 nm。
   9. 选择 xyt 采集模式，并为每个采集和井选择要采集的帧数（例如 5,000）。
   10. 如果系统配备了高通量模式，请引入每个孔的坐标和每个孔的采集次数，以实现该过程的自动化。
       注意:如果使用浸没物镜，请小心确保有饮水机。
   11. 如果系统配备了灌注系统，则加载 BB 溶液并编程灌注，使其在^第 5000 帧之后立即开始，以评估二聚化的动力学，同时采集例如 10,000 张图像。
3. 如果使用专为 FCS 设计的环校正水浸物镜，请在油浸物镜/水中加入一滴油。
4. 将 8 孔观察室安装在载物台上。
5. 选择正确的井并专注于解决方案。
   注意:重要提示:避免聚焦在靠近底部玻璃的位置，以避免反射和散射。当更深入地关注解决方案时，请断开 Automated focus 选项。
6. 开始采集并以 TIFF 格式保存生成的图像堆栈。

4. 使用 R 包 nandb 进行去趋势和亮度分析

1. 作为预处理质量检查，使用 ImageJ 查看图像并恢复强度分布，如图 2a 所示。这对于确定是否发生了过多的光漂白很有用。如果漂白过多，则数据不适合进一步分析。
   注意: ImageJ 还可用于将图像从商业格式转换为 TIFF。下面描述的 nandb 软件只能处理 TIFF 文件。
2. 下载并安装 R 和 RStudio。最好先下载并安装 R，然后再下载并安装 RStudio.
   注意:下面介绍如何使用 nandb R 包。使用 nandb 不需要 R 语言知识，但是，它会让生活更轻松。
3. 安装 nandb 软件包。
   1. 打开 RStudio 并在控制台中键入 install.packages（"nandb"） 并等待安装。
4. 了解 nandb
   1. 查看手册。
   2. 查看各种功能的内置 RStudio 帮助。最有可能使用的函数是 brightness（）。通过键入 ？brightness（） 的 intent 函数。
5. 计算亮度
   1. 假设桌面上有一个名为 img001.tif 的图像文件（请注意，'nandb' 仅适用于 TIFF 文件）。可以计算该图像的亮度:
      b <- brightness（"~/Desktop/img001.tif"， tau = "auto"）
      1. 这会将图像的亮度分配给 R 中的变量 b。tau = "auto" 确保在计算亮度之前正确去除图像的趋势。从这里开始，最常见的事情是计算图像的平均或中值亮度。可以通过键入 mean（b） 或 median（b） 来执行此作。也可以使用
         在桌面上写入亮度图像 ijtiff::write_tif（b， "~/桌面/whatever_img_name"）
   2. 假设桌面上有一个装满图像images_folder文件夹，需要计算这些图像的亮度并将亮度图像写入 TIFF 文件。然后参见 ？brightness_folder（）。此功能一次处理整个文件夹:
      brightness_folder（"~/Desktop/images_folder"， tau = "auto"）
      这对于那些拥有更喜欢 R 的软件的人来说特别好，因为所有文件都在一个命令中处理，然后人们可以继续在他们选择的软件中处理输出亮度 TIFF 图像，无论是 ImageJ、Python 还是其他软件。

图 1.应用 N&B 检测溶液中的蛋白质单体-二聚体转变。（a） 配备激光源（在 mVenus 标记蛋白质的情况下设置为 514 nm）的激光扫描显微镜 （LSM） 的简化光路，该激光源（在我们的例子中设置为 514 nm）指向浸没物镜（在我们的例子中为 63X1.4NA 油）照射 100 nM FKBP12F36V-mVenus 溶液。发射荧光（绿色箭头）穿过二向色镜，并被引导至清洁发射光的带通滤光片，以及位于能够进行光子计数的点数字探测器正前方的 1 个艾里单元处的针孔。（b） 通过 16 x 16 像素扫描共聚焦照明体积，照亮进出高斯形状共聚焦体积的单个 FKBP12F36V-mVenus 分子，产生一系列荧光强度波动。（c） 随时间采集的图像系列

图 2.需要自动去趋势来准确测量溶液中的单体群。（a） 按照协议部分所述采集了 5000 张 16 x 16 像素图像堆栈。第一帧的强度与平均时间分辨强度曲线一起显示，后者显示可能与漂白和其他溶剂和/或光物理效应有关的长期波动。无论这些长期波动的原因是什么，它们都会影响亮度计算，因此需要去除趋势。如果没有自动去趋势，则得到 B = 1.026，而在自动去趋势后，B = 1.005。此外，还显示了不带平滑过滤（左面板，第二行）和带平滑过滤（右面板，第二行）的亮度。（b） 对 （a） 中提供的相同数据进行去趋势处理，并显示强度和亮度的结果。