双分子荧光互补耦合光激活定位显微镜

Abstract

来源:Nickerson， A. et al.， 具有双分子荧光互补的光激活定位显微镜 （BiFC-PALM）。J. Vis. Exp.（2015 年）

该视频介绍了 BiFC-PALM（光激活定位显微镜和双分子荧光互补的组合）来评估蛋白质-蛋白质相互作用。BiFC 涉及两个荧光蛋白片段与两个相互作用的目标蛋白的融合。当两种蛋白质相互作用时，片段会靠近，这使得这两个部分能够聚集在一起并重建功能性荧光蛋白。单个荧光基团的荧光通过 PALM 定位在细胞内的单个分子水平。

Protocol

1. 克隆

1. 确定要克隆的配置并选择链接器。如下所述，用 N 端或 C 端的片段标记蛋白质，这样它们就不会破坏它们的正确定位。使用灵活的链接器，例如 （GGGGS）x2。
2. 将目标蛋白遗传标记到 PAmCherry1 片段。作为一种选择，使用材料列表中列出的克隆质粒，其中包含片段 RN（PAmCherry1 残基 1-159）和 RC（Met 加 PAmCherry1 残基 160-236）和侧翼 MCS 序列。
   在
   1. 插入点用反向 PCR（或限制性消化）将含有片段 RN 和 RC 的质粒线性化。用于反向 PCR 的引物列于表 1 中。以下是作者实验室中使用的 PCR 方案示例（有关该方案中使用的确切材料，请参阅材料清单）。
      1. 将 PCR 反应物混合在一起，用水使最终体积达到 50 μl:向薄壁 PCR 管中加入水、25 μl 2x 预混液、0.5 μl 正向和反向引物（20 μM 稀释原液，0.2 μM 终浓度）和 1 ng 模板。使用以下循环条件:98 °C 30 秒，98 °C 30 秒和 68 °C 2 分钟的 30 个循环，最后在 72 °C 下延伸 10 分钟。
   2. PCR 目标基因，以插入到含有 RN 和 RC 片段的线性化质粒中。如步骤1.2.1所示进行PCR，延伸时间为68°C。....

Materials