双分子荧光互补偶联光激活定位显微镜技术

摘要

来源：Nickerson, A. 等，双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）。J. Vis. Exp. (2015)

本视频介绍了BiFC-PALM技术——即光激活定位显微镜与双分子荧光互补技术的结合，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。双分子荧光互补（BiFC）技术涉及将两种目标相互作用蛋白分别与两个荧光蛋白片段融合。当这两个蛋白发生相互作用时，荧光蛋白片段被拉近至彼此邻近的位置，从而能够结合并重建出具有功能的完整荧光蛋白。通过PALM技术，可在单分子水平上对细胞内单个荧光分子的荧光信号进行精确定位。

方案

1. 克隆

1. 确定要克隆的构型并选择连接子。按照下文所述，在目标蛋白的N端或C端添加片段标签，以避免干扰其正常定位。可使用如(GGGGS)x2的柔性连接子。
2. 将目标蛋白与 PAmCherry1 片段进行遗传标记。一种可选方法是使用材料列表中所列的克隆质粒，这些质粒包含 RN 片段（PAmCherry1 氨基酸残基 1-159）和 RC 片段（甲硫氨酸及 PAmCherry1 氨基酸残基 160-236），并带有侧翼的多克隆位点（MCS）序列。
   1. 使用反向PCR（或限制性酶切）在插入位点将含有RN和RC片段的质粒线性化。反向PCR所用引物列于 表1以下为作者实验室使用的一个PCR实验方案示例（参见材料列表 有关本方案中使用的确切材料）。
      1. 将PCR反应液混合，加水至终体积为50 µl：向薄壁PCR管中加入水、25 µl的2x预混液、正向和反向引物各0.5 µl（20 µM稀释储备液，终浓度为0.2 µM）以及1 ng模板。采用以下扩增程序：98 °C预变性30秒，30个循环（98 °C变性7秒，68 °C退火延伸2分钟），最后72 °C延伸10分钟。
   2. PCR 扩增目的基因，用于插入含有 RN 和 RC 片段的线性化质粒。按照步骤进行 PCR 1.2.1 延伸时间在 68 °C 下进行。使用带....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜支架	尼康	Ti-U
60倍油镜TIRF物镜，数值孔径1.49	尼康	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD相机	安道尔	iXon Ultra 897
561 nm 激光器	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm 激光器	相干	CUBE-405 50mW
561 nm 二向色镜	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm 滤光片	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm 陷波滤光片	Semrock	NF01-405/488/568-25
温度和 CO2 控制载台	东海日立	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
ENTR-D-TOPO PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/
Phusion高保真DNA聚合酶	赛默飞世尔科技	F-531
In-Fusion HD 克隆	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power 慢病毒包装	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE 转染试剂	罗氏	13873800
Lab-Tek II 培养皿盖玻片	赛默飞世尔科技	155409	#1.5 玻璃底培养皿
U2OS细胞	ATCC	HTB-96
293T/17 细胞	ATCC	CRL-11268
含酚红的DMEM	Life Technologies	11995
无酚红DMEM	Life Technologies	21063
胎牛血清	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15，无酚红	Life Technologies	21083-027
低血清培养基	Life Technologies	31985
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	14040
注射器	BD 生物科学	309604
注射器滤器	Millipore	SLHV033RB
慢病毒浓缩剂	Clontech	631231
逆转录病毒浓缩器	Clontech	631455
10 cm 培养皿	BD 生物科学	353003
6孔培养板	BD 生物科学	353046
Polybrene	BD 生物科学	353046
嘌呤霉素	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	新霉素
多西环素	Fisher	BP2653
Tris 碱	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
氢氧化钠	Sigma	S5881
多聚甲醛	Sigma	158127
戊二醛	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
硫酸镁	Sigma	M2643
氢氧化钾	Sigma	221473
氯化钠	Fisher	BP358
氯化镁	Fisher	M33
100 nm 金颗粒	BBI Solutions	EM.GC100
分子生物学级水	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
质粒小提试剂盒	Qiagen	27104
中量提取试剂盒	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml 微型离心管	Fisher	05-408-120
1.5 ml 微量离心管	Fisher	05-408-137
15 ml 离心管	Fisher	05-539-12
5 ml 聚丙烯圆底管	BD 生物科学	352063
14 ml 聚丙烯圆底管	BD 生物科学	352059
50 ml 离心管	BD 生物科学	352070
PCR管	GeneMate	C-3328-1
SOC培养基	Life Technologies	15544
LB肉汤	BD 生物科学	244610
硫酸卡那霉素	Fisher	BP906
感受态细胞	Life Technologies	C4040