1. 克隆
- 确定要克隆的构型并选择连接子。按照下文所述，在目标蛋白的N端或C端添加片段标签，以避免干扰其正常定位。可使用如(GGGGS)x2的柔性连接子。
- 将目标蛋白与 PAmCherry1 片段进行遗传标记。一种可选方法是使用材料列表中所列的克隆质粒，这些质粒包含 RN 片段（PAmCherry1 氨基酸残基 1-159）和 RC 片段（甲硫氨酸及 PAmCherry1 氨基酸残基 160-236），并带有侧翼的多克隆位点（MCS）序列。
- 使用反向PCR（或限制性酶切）在插入位点将含有RN和RC片段的质粒线性化。反向PCR所用引物列于 表1以下为作者实验室使用的一个PCR实验方案示例（参见材料列表 有关本方案中使用的确切材料）。
- 将PCR反应液混合，加水至终体积为50 µl：向薄壁PCR管中加入水、25 µl的2x预混液、正向和反向引物各0.5 µl（20 µM稀释储备液，终浓度为0.2 µM）以及1 ng模板。采用以下扩增程序：98 °C预变性30秒，30个循环（98 °C变性7秒，68 °C退火延伸2分钟），最后72 °C延伸10分钟。
- PCR 扩增目的基因，用于插入含有 RN 和 RC 片段的线性化质粒。按照步骤进行 PCR 1.2.1 延伸时间在 68 °C 下进行。使用带有突出端的引物，突出端包含柔性连接序列，例如 (GGGGS)x2 对应的序列为 GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT，并具有 15 个碱基对与线性化 RN 和 RC 质粒末端同源的序列，以用于重组。
注意： 目的蛋白的引物悬臂序列如下所示 表 2 如果使用引物进行 表1 线性化质粒骨架。
- 用DpnI消化PCR反应以消除PCR模板。将0.5 µl DpnI（20 U/µl）直接加入50 µl PCR反应体系中，37 °C孵育1小时，然后80 °C加热失活20分钟。如果后续步骤中背景模板仍然存在，可增加酶用量或延长消化时间。
- 纯化PCR产物 通过 一种离心柱，具体操作按制造商说明进行。
- 使用无缝克隆反应将含有RN或RC片段的线性化质粒与目的基因进行连接。测定纯化后的PCR产物浓度：取50 ng线性化质粒和50 ng目的基因，加入1 µl酶预混液，用去离子水补足总体积至5 µl。50 °C孵育15分钟，置于冰上，再加入20 µl TE缓冲液。
- 将重组质粒转化至感受态细菌中。
- 挑选2至4个或更多（根据需要）菌落进行过夜培养。在14 ml聚丙烯圆底试管中加入5 ml LB液体培养基和5 µl卡那霉素（50 mg/ml母液），用灭菌接种环挑取所选细菌菌落加入其中。于37 °C、225 rpm振荡条件下过夜培养。
- 将1 ml过夜培养物加入甘油冻存管中冷冻保存，其余菌液按照试剂盒说明书进行质粒小提。
- 进行测序以确定优质克隆。若使用克隆质粒中的 材料清单必要时使用M13正向和反向引物（分别进行反应）以获得融合构建体的完整序列。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的比对工具（如BLAST）将测序结果与预期序列进行比对分析 - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi。
- 通过重组酶反应将序列验证正确的构建体转移至表达质粒中。
- 加入75 ng目的质粒（如用于瞬时转染的pcDNA或用于慢病毒包装的pLenti）和50 ng重组克隆质粒至1 µl酶预混液中，用去离子水将总体积补至5 µl。25 °C孵育1小时，然后加入5 µl TE缓冲液。
注意： 在慢病毒包装和稳定细胞系构建中，每种构建体应使用不同的目的质粒，例如一种带有嘌呤霉素抗性，另一种带有新霉素抗性，以便对转导细胞进行双重筛选。同时需考虑各质粒所使用的启动子，如用于高水平表达的组成型巨细胞病毒（CMV）启动子，或带有TetO操纵元件的CMV启动子以实现可调节的多西环素诱导表达。
- 将5 µl转化至感受态细菌中，并按步骤进行质粒小量提取 1.2.6 至 1.2.8，但使用适当的抗生素（通常为氨苄青霉素）。
- 确定最佳的双分子荧光互补（BiFC）配置。
- 将表达质粒共转染至U2OS细胞（或选用的其他细胞）。
- 向8孔#1.5玻璃底培养板的每个孔中加入350 µl不含酚红和抗生素、并添加10% FBS的DMEM培养基。每孔接种约7.5 × 10⁴4 每孔细胞数使细胞在次日达到约70%–90%汇合度。
- 铺板后第二天，使用首选转染试剂并按照制造商说明，将不同构型的表达质粒共转染至每个孔中。
- 每个孔中，将125 ng的每种表达质粒加入含有50 µl无血清减量培养基的0.6 ml离心管中，用移液器吹打混匀。将1 µl转染试剂沿管壁缓慢加入管中心并直接进入培养基中。轻轻振荡混匀，室温静置反应30分钟。
- 将腔室载玻片各孔中的培养基减少约一半。将转染混合物逐滴加入各孔中，并轻轻振荡混匀。于37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞2 孵育24-48小时。转染后第二天更换培养基。
- 从第2步开始，在荧光显微镜下对细胞进行成像 步骤 2.1.4.
注意： 如果表达水平较高且相机对PAmCherry1相对较低的光子输出足够敏感，样品可在标准荧光显微镜下成像。在使用绿色激发（561 nm）滤光片组成像前，可先用紫外滤光片组（405 nm）激活重建的PAmCherry1分子。
- 在适用情况下，可通过例如在目标蛋白之一中引入破坏相互作用的点突变来建立阴性对照。对需要突变的蛋白的克隆质粒以及选定的构建形式进行定点突变。
- 通过将构建体包装成病毒颗粒并感染U2OS细胞（或选定的细胞系）来生成稳定细胞系。可考虑使用可诱导（四环素）表达系统，以便在成像前诱导表达，特别是在BiFC的不可逆性持续时间较长成为问题时，或需要可调节表达的情况下。
注意： 处理病毒被归类为生物安全二级。尽管近年来的病毒包装系统已大大降低了产生具有复制能力病毒的可能性，但仍存在一些风险。相关参考文献可参见 http://www.cdc.gov/biosafety/publications/。
- 重复步骤 1.2.10 使用慢病毒或逆转录病毒目的载体。将过夜培养体积增加至100 ml，以进行中量质粒提取并获得更高纯度的质粒。
- 第1天：接种约 2 x 106 为每种待包装的构建体，将293T/17细胞接种至10 cm培养皿中。
- 第2天：根据所选转染试剂的制造商说明，配制转染反应体系。
- 将包装质粒1和2配制成终浓度为250 ng/µl、包装质粒3配制成终浓度为100 ng/µl的无菌水预混液。取10 µl该包装质粒预混液与2.5 µg目标质粒加入1 ml无血清减量培养基中，置于5 ml聚丙烯圆底管内，用移液器吹打混匀。将20 µl转染试剂沿管壁中心直接加入培养基中。
- 轻轻振荡混匀，在室温下孵育30分钟。吸除约一半的培养基，逐滴加入转染混合物。轻轻摇动混匀，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2. 每块培养板将10 ml培养基放入试管中，松开管盖，于37°C、5% CO₂条件下孵育2 平衡
- 第3天：用预孵育的培养基轻轻更换原培养基，并将细胞放回培养箱。另取一管培养基，松开管盖后一同放入培养箱孵育。注意：合胞体（即多核巨细胞）的形成可能是包装过程顺利的标志。然而，此时细胞状态脆弱，容易脱落。更换培养基时，应将移液器倾斜至水平，沿培养板边缘逐滴加入培养基。
- 第4天：用注射器吸出培养基，经0.45 µm孔径滤膜过滤后收集病毒至干净的50 ml离心管中。轻柔地加入预温育的培养基以替换原有培养基。
- 第5天：按照之前步骤中的方法再次收获 1.5.3.3 将共同的滤液合并至同一支50 ml离心管中。每管加入6 ml病毒浓缩液，混匀。4 °C孵育至少24小时，直至病毒沉淀。
注意： 根据细胞的健康状况，病毒可进行第三次收获。
- 在4 °C下以1,500 × g离心15分钟浓缩病毒。吸除上清液，将沉淀重悬于250 µl培养基中。病毒可立即用于感染实验，或分装为50 µl每份，于-80 °C保存，最长可保存一年。
- 接种约 3 x 105 将U2OS（或靶细胞）以每孔2 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基于6孔板中接种，每孔接种适量细胞，使感染时细胞融合度约为50%。
- 次日，移除约一半的培养基，使每孔剩余约1 ml。每孔加入50 µl浓缩病毒进行共感染，再加入1 µl聚凝胺（8 mg/ml）。于37 °C、5% CO₂条件下孵育2第二天更换培养基，再孵育一天后进行抗生素筛选。
注意： 添加的病毒量可根据所需的感染率而变化。可使用qRT-PCR对病毒进行滴定。
- 加入抗生素以筛选感染的细胞。需要设置未接触病毒的未感染细胞作为对照，用于检测筛选效果。孵育2-7天，或直至筛选完成。
注意： 有效浓度应先进行滴定，但通常嘌呤霉素为1.0 µg/ml，新霉素为1.0 mg/ml。
- 将细胞扩增至更大的10 cm培养皿中，并继续进行方案2。
2. 成像固定细胞
- 准备用于成像的样品
- 通过加入250 µl的1 M NaOH溶液处理8孔#1.5玻璃底培养皿至少1小时，随后用PBS充分洗涤。
注意：未经处理的培养皿通常会导致较高的背景信号。此外，细胞可能对残留的NaOH敏感，若未彻底清洗玻璃表面（可能需要多达10次洗涤），可能导致细胞贴壁困难。如有必要，可在洗涤后将清洗好的培养皿在PBS中孵育过夜。对于敏感的细胞系，可提高接种密度（例如初始汇合度为50%–60%）以改善贴壁。
- 在每孔350 µl含10% FBS的酚红-free DMEM培养基中接种约5.5 × 104个U2OS稳定表达细胞，确保成像时细胞状态健康且未过度汇合。
- 根据实验需求进行必要的处理，例如添加四环素以诱导蛋白表达。
- 成像前立即固定细胞。
- 固定前，配制新鲜的多聚甲醛（PFA）固定液——在1× PHEM缓冲液中加入3.7% PFA和0.1%戊二醛（GA）。配制10 ml PFA溶液时，称取0.37 g PFA，转移至1.5 ml离心管中，加入1 ml蒸馏水和30 µl 1 M NaOH，涡旋混匀。于70 °C加热，并每隔1–2分钟涡旋一次，直至PFA完全溶解。
- 将溶解后的PFA转移至15 ml锥形管中，加入3.8 ml蒸馏水、5 ml 2× PHEM缓冲液和20 µl 25%戊二醛，涡旋混匀。2× PHEM缓冲液的组成为：120 mM PIPES、50 mM HEPES、20 mM EGTA和16 mM MgSO4，用10 M KOH调节pH至7.0。该固定液可在4 °C保存数天。
注意：PFA和GA均为有害物质，应在通风橱中配制，并在操作时佩戴适当的个人防护装备。避免吸入或皮肤直接接触。
- 移除培养基，用500 µl PBS快速洗涤一次，每孔加入250 µl PFA固定液，在室温下孵育20分钟。
- 移除PFA固定液，每孔加入350 µl PBS或成像缓冲液（含100 mM Tris、30 mM NaCl和20 mM MgCl2，pH 8.5）。
- 涡旋混匀100 nm金颗粒以分散聚集体，每孔加入35 µl（终浓度为10倍稀释），用于成像过程中校正载物台漂移。
- 采集图像
- 开启显微镜，打开405 nm和561 nm激光器，但此时保持快门（内部或外部）关闭。开启EMCCD相机并使其冷却。确认561 nm滤光片已正确安装。
- 打开采集软件，设置曝光时间为100毫秒，EMCCD增益为300（范围1–1,000）。
- 在物镜上添加浸油，并将样品固定于显微镜载物台上。
- 使用明场或561 nm激光（约1 kW/cm2）将样品调至焦点。
- 对于Ras及其他膜蛋白的成像，使用60倍复消色差TIRF物镜（数值孔径1.49），并将显微镜设置为TIRF模式。调节激发激光，使其偏心入射至TIRF物镜的后焦平面，从而使激光在到达样品时发生偏折。持续调节激光位置，直至达到临界角并发生全反射。寻找一个视野中包含多个金颗粒的细胞，设定一个包含该细胞（或细胞内某一区域）及金颗粒的兴趣区域。
注意：TIRF可减少激发光的穿透深度，降低离焦背景信号。此外，视野中金颗粒越多，漂移校正的准确性通常越高。
- 如设备支持，启用自动对焦系统以校正样品在z方向的漂移；否则，在采集过程中若图像失焦，需手动调节焦点。
- 开始采集时，保持405 nm激光关闭，仅开启561 nm激光（约1 kW/cm2），以防已有足够的激活（通常在表达水平较高时发生）。否则，将405 nm激光设为最低出厂功率（0.02 mW或0.01 W/cm2），并根据需要逐步增加（每次0.1 mW），直至每帧图像中出现数十个分子，且单分子之间分离良好。
- 在数据采集过程中，逐渐增加405 nm激光功率，以维持斑点密度基本恒定。注意：在较低的405 nm激发功率下，部分PAmCherry1可能已被激活。随着这些分子发生光漂白，剩余可光激活的PAmCherry1分子数量减少，因此需要更高的光子通量来维持每帧图像中荧光发射分子的密度。
- 持续采集图像，直至即使使用高功率405 nm激光（2.5–10 W/cm2）也无法再激活新的荧光事件。
注意：总采集时间取决于蛋白表达水平及互补效率。
表1. 用于线性化含有PAmCherry1片段的克隆质粒的引物。 含有RN和RC的克隆质粒可通过反向PCR在插入位点处进行线性化，插入位点位于片段的N端或C端。序列以5'至3'方向列出。
| 引物序列（5' 至 3'） |
| N端插入克隆质粒反向引物 | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| N端RN正向引物 | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| N端RC正向引物 | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| C端插入克隆质粒正向引物 | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| C端RN反向引物 | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| C端RC反向引物 | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
表2. 与表1引物匹配的目的基因引物的突出端序列。
连接无关反应所需的15个碱基对同源序列由引物的突出端产生。此外，这些突出端包含一个(GGGGS)x2柔性连接序列。该柔性连接序列也可添加至表1中的引物上。所有序列均按5'到3'方向列出。
| 目的基因引物的突出序列（5' 至 3'） |
| N端插入 RN 或 RC 正向引物 | GAGCTCGGTACCATG |
| N端插入 RN 反向引物 | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| N端插入 RC 反向引物 | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C端插入 RN 正向引物 | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C端插入 RC 正向引物 | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C端插入 RN 或 RC 反向引物 | GCGCCCACCCTTTTA |
