双分子荧光互补耦合光激活定位显微镜

摘要

来源:Nickerson， A. et al.， 具有双分子荧光互补的光激活定位显微镜 （BiFC-PALM）。J. Vis. Exp.（2015 年）

该视频介绍了 BiFC-PALM（光激活定位显微镜和双分子荧光互补的组合）来评估蛋白质-蛋白质相互作用。BiFC 涉及两个荧光蛋白片段与两个相互作用的目标蛋白的融合。当两种蛋白质相互作用时，片段会靠近，这使得这两个部分能够聚集在一起并重建功能性荧光蛋白。单个荧光基团的荧光通过 PALM 定位在细胞内的单个分子水平。

方案

1. 克隆

1. 确定要克隆的配置并选择链接器。如下所述，用 N 端或 C 端的片段标记蛋白质，这样它们就不会破坏它们的正确定位。使用灵活的链接器，例如 （GGGGS）x2。
2. 将目标蛋白遗传标记到 PAmCherry1 片段。作为一种选择，使用材料列表中列出的克隆质粒，其中包含片段 RN（PAmCherry1 残基 1-159）和 RC（Met 加 PAmCherry1 残基 160-236）和侧翼 MCS 序列。
   在
   1. 插入点用反向 PCR（或限制性消化）将含有片段 RN 和 RC 的质粒线性化。用于反向 PCR 的引物列于表 1 中。以下是作者实验室中使用的 PCR 方案示例（有关该方案中使用的确切材料，请参阅材料清单）。
      1. 将 PCR 反应物混合在一起，用水使最终体积达到 50 μl:向薄壁 PCR 管中加入水、25 μl 2x 预混液、0.5 μl 正向和反向引物（20 μM 稀释原液，0.2 μM 终浓度）和 1 ng 模板。使用以下循环条件:98 °C 30 秒，98 °C 30 秒和 68 °C 2 分钟的 30 个循环，最后在 72 °C 下延伸 10 分钟。
   2. PCR 目标基因，以插入到含有 RN 和 RC 片段的线性化质粒中。如步骤1.2.1所示进行PCR，延伸时间为68°C。使用具有突出端的引物，其中包含灵活的接头序列，例如GGAGGTGGGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAGAGGGAAGT（GGGGS）x2，以及与线性化RN和RC质粒末端的15个碱基对同源性以进行重组><。 注意: 如果使用表 1 中的引物对质粒骨架进行线性化，则目标蛋白质的引物突出端如表 2 所示。
   3. 用 Dpn1 消化 PCR 反应以去除 PCR 模板。将 0.5 μl Dpn1 （20 U/μl） 直接添加到 50 μl PCR 反应中。在 37 °C 下孵育 1 小时，然后在 80 °C 下热灭活 20 分钟。如果背景模板在后续步骤中仍然存在，请增加酶量或延长消化时间。
   4. 按照制造商的说明，通过离心柱纯化 PCR 产物。
   5. 进行不依赖连接的反应，将含有 RN 或 RC 片段的线性化质粒与目标基因混合。测量纯化的 PCR 产物的浓度:将 50 ng 线性化质粒和 50 ng 目标基因与 1 μl 酶预混液混合，并用去离子水使总体积达到 5 μl。在 50 °C 下孵育 15 分钟，置于冰上，并加入 20 μl TE 缓冲液。
   6. 将重组质粒转化为感受态细菌。
   7. 选择 2-4 +（根据需要）菌落进行 O/N 培养。将 5 ml LB 肉汤和 5 μl 卡那霉素（50 mg/ml 原液）加入 14 ml 聚丙烯圆底管中，并加入带有灭菌接种环的选定细菌菌落。在 37 °C O / N 下孵育，同时以 225 rpm 振荡。
   8. 冷冻 1 ml 甘油原液的 O/N 培养物，并按照制造商的说明对剩余部分进行小量制备。
   9. 执行测序以确定好的克隆。如果使用材料列表中的克隆质粒，请根据需要使用 M13 正向和反向引物（在单独的反应中）以获得融合构建体的完整序列。使用比对工具（例如美国国家生物技术信息中心 （NCBI） 的 BLAST）与预期序列进行比较 - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi。
   10. 通过重组酶反应将序列验证的构建体转移到表达质粒上。
       1. 将 75 ng 目标质粒（例如用于瞬时转染的 pcDNA 或用于慢病毒包装的 pLenti）和 50 ng 重组克隆质粒加入 1 μl 酶预混料中，并用去离子水使总体积达到 5 μl。在 25 °C 下孵育 1 小时，然后加入 5 μl TE 缓冲液。
          注意: 对于慢病毒包装和稳定细胞系生成，为每个构建体使用不同的目标质粒，例如，一个具有嘌呤霉素抗性，另一个具有新霉素。这允许对转导的细胞进行双重选择。还要考虑每种的启动子，例如用于高表达水平的组成型巨细胞病毒 （CMV） 启动子，或用于可调多西环素调节表达的带有 TetO纵子的 CMV。
       2. 将 5 μl 转化到感受态细菌中，并按照步骤 1.2.6 至 1.2.8 小量制备质粒，但使用适当的抗生素（通常为氨苄青霉素）。
3. 确定最佳 BiFC 配置。
   1. 将表达质粒共转染到 U2OS 细胞（或选择的细胞）中。
      1. 将 350 μl 不含酚红和不含抗生素的 DMEM，补充有 10% FBS 添加到 8 孔 #1.5 玻璃底室载玻片的每个孔中。每孔接种约 7.5 x 10⁴ 个细胞，以便第二天细胞达到约 70%-90% 的汇合度。
      2. 铺板后第二天，使用首选试剂在每个孔中共转染不同配置的表达质粒，如制造商所述。
         1. 对于每个孔，将 125 ng 每种表达质粒加入 0.6 ml 试管中的 50 μl 无血清还原培养基中，并上下移液以混合。沿试管中心向下添加 1 μl 转染试剂，直接加入培养基中。轻轻搅拌混合，让反应静置 30 分钟。
         2. 将腔室载玻片每个孔中的培养基减少约一半。将转染混合物滴加到孔中，轻轻摇晃混合。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 24-48 小时。转染后第二天更换培养基。
   在
   2. 荧光显微镜上对细胞进行成像，如方案 2 中从步骤 2.1.4.
      开始 注意:如果表达水平高并且相机对 PAmCherry1 相对较低的光子输出足够敏感，则可以在标准荧光显微镜上对样品进行成像。重组的 PAmCherry1 分子可以用紫外滤光片组 （405 nm） 激活，然后再用绿色激发 （561 nm） 滤光片组成像。
4. 在适用的情况下，创建阴性对照，例如，将点突变引入破坏相互作用的目标蛋白质之一。对待突变蛋白质和所选配置的克隆质粒进行定点诱变。
5. 通过将构建体包装到病毒颗粒中并感染 U2OS 细胞（或选择的细胞系）来生成稳定的细胞系。考虑使用诱导型（四环素）表达系统，这样如果 BiFC 的长期不可逆性是一个问题，或者需要可调节的表达，则可以在成像前诱导表达><。 谨慎:与病毒打交道被归类为生物安全 2 级。虽然最近几代病毒包装系统大大降低了产生具有复制能力的病毒的可能性，但仍然存在一些风险。参考资料可在 http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/ 上找到。
   1. 使用慢病毒或逆转录病毒目标载体重复步骤 1.2.10。将 O/N 培养物增加到 100 ml，以进行中量提取和更高纯度的质粒。
   2. 第 1 天:将大约 2 x 10⁶ 293T/17 个细胞接种到 10 cm 培养皿中，每个要包装的构建体。
   3. 第 2 天:使用所选的转染试剂制备转染反应，并按照制造商的说明进行制备。
      1. 制备包装质粒的预混料，终浓度为 250 ng/μl，用于包装质粒 1 和 2，制备 100 ng/μl，用于在无菌水中包装质粒 3。将 10 μl 填充质粒预混料和 2.5 μg 目标质粒加入 5 ml 聚丙烯圆底管中的 1 ml 无血清还原培养基中，并上下移液以混合。沿试管中心向下添加 20 μl 转染试剂，直接加入培养基中。
         1. 轻轻搅拌混合并在 RT 下孵育 30 分钟。从细胞中取出约一半的培养基，然后逐滴加入转染混合物。轻轻摇晃混合，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。将每板 10 ml 培养基在试管中孵育，松开盖子以保持温度和 CO₂ 平衡。
   4. 第 3 天:用预孵育的培养基轻轻更换培养基，然后将细胞放回培养箱中。在松开盖子的情况下孵育另一管培养基。注意:合胞体或大多核细胞的形成可能表明包装进展顺利。然而，细胞处于脆弱状态，很容易分离。更换培养基时，倾斜移液器使其水平，并将培养基逐滴添加到板的一个边缘。
   5. 第 4 天:用注射器去除培养基并通过 0.45 μm 孔径过滤器过滤到干净的 50 ml 试管中，收获病毒。用预孵育的培养基轻轻更换培养基。
   6. 第 5 天:按照之前的步骤 1.5.3.3 再次收获，并将普通滤液混合到同一个 50 ml 管中。向每管中加入 6 ml 病毒浓缩器并混合。在 4 °C 下储存至少 24 小时，直到病毒沉淀><。 注意: 根据细胞的健康状况，可以第三次收获病毒。
   7. 通过在 4 °C 下以 1,500 x g 离心 15 分钟来浓缩病毒。吸出上清液并将沉淀重悬于 250 μl 培养基中。病毒可立即用于感染，或以 50 μl 等分试样在 -80 °C 下储存长达一年。
   8. 将每孔约 3 x 10 个 5 U2OS（或靶标）细胞接种到 6 孔板（每孔 2 ml DMEM 和 10% FBS）中进行感染，因此细胞在感染时约为 50% 汇合。
   9. 第二天，去除大约一半的培养基，剩余约 1 ml。每个构建体与 50 μl 浓缩病毒同时fect。向每个孔中加入 1 μl 聚凝胺 （8 mg/ml）。在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。第二天更换培养基，再孵育一天，再选择抗生素。
      注意: 要添加的病毒量可能因所需的感染率而异。病毒可以使用 qRT-PCR 进行滴定。
   10. 添加抗生素以选择受感染的细胞。需要将未感染细胞且未见过病毒的单独孔作为金丝雀来测试选择的有效性。孵育 2-7 天，或直到选择完成。
       注意: 最初应滴定有效浓度，但嘌呤霉素通常为 1.0 μg/ml，新霉素通常为 1.0 mg/ml。
   11. 将细胞扩增到更大的 10 cm 培养皿中，然后继续执行方案 2。

2. 固定细胞成像

1. 制备用于成像的样品
   1. 加入 250 μl 1 M NaOH 至少 1 小时，清洁 8 孔 #1.5 玻璃底腔室载玻片，并用 PBS 彻底洗涤。
      注意: 未经处理的腔室玻片通常会导致高背景信号。此外，细胞可能对残留的 NaOH 敏感，未能彻底清洁玻璃表面（多达 10 次洗涤）可能会使细胞粘附变得困难。如有必要，洗涤后将清洁后的腔室载玻片与 PBS O/N 一起孵育。对于敏感细胞系，以更高的密度铺板（例如，初始汇合度为 50%-60%）可能会有所帮助。
   2. 在 350 μl 含 10% FBS 的不含酚红的 DMEM 中，每孔接种约 5.5 x 10⁴ 个 U2OS 稳定表达细胞，以便细胞健康且在成像时不会过度汇合。
   3. 对实验进行必要的处理，例如添加四环素以诱导蛋白质表达。
   4. 成像前立即固定细胞。
      1. 固定前，准备新鲜的多聚甲醛 （PFA） 溶液 — 3.7% PFA 溶于 1x PHEM 和 0.1% 戊二醛 （GA） 中。对于 10 ml PFA 溶液，称取 0.37 g PFA 并转移到 1.5 ml 微量离心管中。加入 1 ml 蒸馏水和 30 μl 1 M NaOH 并涡旋。在 70 °C 下加热，每 1-2 分钟涡旋一次，直到 PFA 完全溶解。
      2. 将溶解的 PFA 转移到 15 ml 锥形管中，加入 3.8 ml 蒸馏水、5 ml 2x PHEM 缓冲液、20 μl 25% 戊二醛，涡旋混合。原液，2x PHEM 缓冲液为 120 mM PIPES、50 mM HEPES、20 mM EGTA 和 16 mM MgSO_4，pH 值调节至 7.0,10 M KOH。该固定液可在 4 °C 下储存数天><。 谨慎:PFA 和 GA 都是危险的。在通风橱中制备溶液，并在处理这两种化学品时佩戴适当的防护设备。避免吸入或直接皮肤接触。
      3. 去除生长培养基。用 500 μl PBS 快速洗涤，每孔加入 250 μl PFA 固定剂。在 RT 下将细胞孵育 20 分钟。
   5. 从样品中取出 PFA 固定剂，每孔加入 350 μl PBS 或成像缓冲液（100 mM Tris，含 30 mM NaCl 和 20 mM MgCl_2，pH 8.5）。
   6. 涡旋 100 nm 金颗粒以分解聚集体，并每孔添加 35 μl（10 倍最终稀释度）以跟踪成像过程中的载物台漂移。
2. 获取图像
   1. 打开显微镜。打开 405 和 561 nm 激光器的电源，但此时保持快门（内部或外部）关闭。打开 EMCCD 摄像头并让其冷却。确保 561 nm 滤光片就位。
   2. 打开采集软件，将曝光时间设置为 100 毫秒，将 EMCCD 增益设置为 300（范围 1 – 1,000）。
   3. 在物镜中加入浸油，并将样品固定在显微镜载物台上。
   4. 使用明场或 561 nm 激光 （~1 kW/cm²） ，使样品聚焦。
   5. 对于Ras和其他膜蛋白的成像，使用数值孔径为1.49的60倍复消色差TIRF物镜，并将显微镜置于TIRF配置中。调整激发激光，使其在撞击 TIRF 物镜的后孔径时偏离中心;这会导致激光在到达样品时发生偏转。继续调整激光，直到达到临界角并且激光被反射回来。搜索要成像的单元格，其中有多个金颗粒。设置一个包含单元（或单元内的区域）和金粒子的感兴趣区域。
      注意:TIRF 降低了激发激光的穿透深度，并减少了离焦背景信号。此外，当看到更多的金颗粒时，漂移校正可能更准确。
   6. 如果可用，请使用自动对焦系统以校正 z 方向的样品漂移。否则，如果图像失焦，请在整个采集过程中手动调整焦距。
   7. 在已经发生足够的激活的情况下（通常如果表达水平很高），在关闭 405 nm 激光并打开 561 nm 激光 （~1 kW/cm²） 的情况下开始采集。否则，以最低出厂功率设置（0.02 mW 或 0.01 W/cm²）打开 405 nm 激光器，并根据需要逐渐增加（一次 0.1 mW），直到每帧有几十个分子或单个分子充分分离。
   8. 随着数据采集的继续，逐渐增加 405 nm 激光功率以保持光斑密度大致恒定。注意:在较低的 405 nm 激发功率下，一些 PAmCherry1 已经可以被激活。当这些分子发生光漂白时，剩余的可光激活 PAmCherry1 分子的数量减少，需要更高的光子通量来保持在每个帧中发射荧光的分子密度相同。
   9. 继续图像采集，直到 405 nm 高功率 （2.5 – 10 W/cm²） 不再激活更多激活事件><。 注意: 总采集时间取决于互补的表达水平和效率。

表 1.用于线性化含有 PAmCherry1 片段的克隆质粒的引物。含有 RN 和 RC 的克隆质粒可以在片段的 N 端或 C 端插入点用反向 PCR 线性化。序列列在 5' 到 3' 之间。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 引物序列（5' 至 3'） 用于在 N 端反向插入的克隆质粒 CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC RN 在 N 端向前 GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA RC 位于 N 端向前 GGCGCCCTGAAGGGCGA 用于在 C 端向前插入的克隆质粒 TAAAAGGGTGGGCGCGCC 来自 C 端反向的 RN GTCCTCGGGGTACATCCGCTC 来自 C 端反向的 RC CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG

表 2.与表 1 引物匹配的目的基因引物的突出端。

连接非依赖性反应的 15 个碱基对由引物突出端产生。此外，悬垂包括 （GGGGS）x2 柔性链接器的序列。可以将灵活的接头序列添加到表 1 中的引物中。序列列在 5' 到 3' 之间。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 目的基因引物的突出端（5' 至 3'） N 端子插入 RN 或 RC 正向 GAGCTCGGTACCATG N 端子插入 RN 反向 ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCCCCCTTGCTCAC N 端子插入 RC 反向 ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC C 端插入 RN 正向 ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT C 端子插入 RC 正向 GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT C 端子插入 RN 或 RC 反向 GCGCCCACCCTTTTA

材料