基于荧光各向异性的蛋白质-蛋白质相互作用检测

摘要

来源：Gijsbers, A.，等。利用荧光各向异性研究蛋白质-蛋白质相互作用。J. Vis. Exp. (2016)。

在本视频中，我们介绍了利用荧光各向异性技术研究荧光标记的Shwachman-Diamond综合征（SBDS）蛋白与延伸因子样1 GTP酶（EFL1）之间相互作用的方法。当将SBDS蛋白与浓度逐步增加的EFL1共同孵育时，观察到各向异性值持续上升，表明这两种蛋白之间发生了有效的相互作用。

方案

1. 使用FlAsH荧光染料4',5'-双(1,3,2-二硫砷烷-2-基)荧光素标记SBDS-FlAsH

1. 在5 µl各向异性缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，300 mM NaCl，5 mM MgCl₂，10%甘油，5 mM β-巯基乙醇）中，将3 nmol的SBDS-FlAsH蛋白（FlAsH标签对应于在重组SBDS蛋白C末端通过基因工程引入的四半胱氨酸基序Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys）与3 nmol的4',5'-双(1,3,2-二硫砷环-2-基)荧光素染料混合。
2. 在4 °C下反应8小时。将样品在各向异性缓冲液中透析过夜，以去除游离染料。
3. 利用朗伯-比尔定律定量标记蛋白的百分比。使用适当体积的石英比色皿，在分光光度计中测定280 nm和508 nm处的吸光度。注意：采用以下摩尔吸光系数（M^-1 cm^-1）：
   方程 1
4. 使用方程2计算标记的SBDS-FlAsH蛋白的浓度。
   方程 2
5. 通过将上一步计算得到的C_SBDS-FlAsH代入方程3，计算总SBDS蛋白的浓度。
   方程 3
6. 使用方程4计算标记蛋白的百分比。
   方程 4

2. 荧光各向异性实验

注意：各向异性实验在配备偏振工具箱的荧光分光光度计上进行，数据采集使用仪器配套软件中的各向异性程序。激发波长设置为494 nm，光谱带宽为8 nm，发射光通过530±25 nm的带通滤光片记录。测量在25 °C下进行，使用体积为200 µl、光程为5 mm的比色皿。

1. 在荧光比色皿中，加入200 µl含30 nM SBDS-FlAsH的各向异性缓冲液，然后逐次滴加2 µl浓度为30 µM的EFL1。充分混匀后，静置反应3分钟，再测定其各向异性值。
2. 重复步骤2.1，直至累计加入40 µl的EFL1。

3. 数据分析

1. 使用非线性最小二乘回归算法将数据拟合到适当的结合模型。最常见的结合模型方程见表1。
2. 通过检查拟合残差来评估描述蛋白质间相互作用的最佳模型，并通过额外实验验证所选模型。

表1. 常见的蛋白质-蛋白质相互作用结合模型及其描述的数学方程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tris 碱	Formedium	TRIS01	超纯
染料 4&rsquo;,5&rsquo;-双(1,3,2-二硫砷环戊烷-2-基)荧光素	ThermoFischer Scientific	LC6090	该试剂盒含有用于标记 a<br/> FlAsH 标签的染料
荧光比色皿&nbsp;	Hellma Analytics&nbsp;	111-057-40
分光光度计&nbsp;	Agilent Technologies&nbsp;	G6860AA&nbsp;	Cary 60 UV-Vis
荧光分光光度计	Olis	无适用编号	配备偏振工具箱的 Olis DM 45
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
NaCl	Formedium	NAC02	氯化钠
MgCl<sub>2</sub>	Merck Millipore Corporation	1725711000	氯化镁
甘油&nbsp;	Sigma-Aldrich&nbsp;	G5516
甘油	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6