检测转录因子-DNA复合物的电泳迁移率变动分析

摘要

来源：Hsieh, Y. W. 等，利用红外荧光染料标记寡核苷酸进行电泳迁移率变动分析的优化方案。J. Vis. Exp. (2016)

在本视频中，我们演示了使用红外荧光标记的DNA探针，通过电泳迁移率变动实验检测蛋白质-DNA相互作用的方法。当蛋白质与DNA探针结合时，会形成一个较大的复合物，在凝胶电泳中迁移较慢，并表现为发生迁移的条带。

方案

1. 结合反应与电泳

1. 通过混合以下试剂制备1 mL 5×结合缓冲液：50 µL 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、10 µL 5 M NaCl、200 µL 1 M KCl、5 µL 1 M MgCl₂₂，0.5 M EDTA（pH 8.0）10 µL；1 M DTT 5 µL；10 mg/mL BSA 25 µL，以及 ddH₂O 695 µL₂O.
   注意： 5×结合缓冲液可分装后于-20 °C保存。还需注意的是，不同的转录因子对结合缓冲液的配方可能有不同的调整要求。
2. 在准备结合反应前，先将5%的天然聚丙烯酰胺凝胶在含有2.5%甘油的0.5×TBE缓冲液中以80 V预电泳30–60分钟，或直至电流不再随时间变化，以彻底去除过硫酸铵残留。
3. 在最终体积为 20 µL 的体系中进行结合反应。
   1. 混合4 µL 5x结合缓冲液与80 - 200 ng纯化的蛋白A（溶于50%甘油中， 即，SOX-2），0.1 µM 荧光染料标记探针 1 µL（终浓度：5 nM），以及 ddH₂O₂O.
   2. 可选：当需要冷探针竞争物时，加入不同浓度（2x, 10x, 25x, 50x, 100x） 等等。冷探针的数量。
   3. 可选：当蛋白质 A 与蛋白质 B 之间的相互作用（即，SOX-2 和 LIM-4）进行检测时，加入 80 - 200 ng 纯化的蛋白质 B（溶于 50% 甘油中， 即，LIM-4。
   4. 可选：当使用核提取物制备且需验证蛋白A的特异性结合时，加入针对蛋白A的特异性抗体（即， 抗-6xHis，抗-FLAG， 等。).
   5. 室温避光孵育15分钟。
4. 将所有结合反应样品上样至凝胶，并以10 V/cm的电压电泳至目标距离。

2. 成像

注意： 凝胶使用高级红外成像系统直接在玻璃板中进行扫描。因此，该凝胶可进一步解析并重复扫描（图1C 和 2）。也曾尝试使用主要用于Western印迹的近红外荧光成像系统对凝胶进行扫描，但仅有高级红外成像系统能够以良好的分辨率完成扫描。所描述的方法针对特定的红外成像软件，尽管也可使用其他软件包。

1. 使用 ddH₂O 清洁扫描仪床面，并在扫描前彻底擦干。将凝胶的玻璃板擦干，然后将装有凝胶的玻璃板放置在扫描仪床面上。
2. 打开红外成像软件，进入“采集”选项卡。当较薄的玻璃板（1 mm）放置在扫描仪床面上时，使用以下设置：通道：700，强度：自动，分辨率：169 µm，质量：中等，焦距偏移：1.5 mm。当较厚的玻璃板（3 mm）放置在扫描仪床面上时，使用以下设置：通道：700，强度：自动，分辨率：84 µm，质量：中等，焦距偏移：3.5 mm。焦距偏移取决于玻璃板的厚度。
3. 选择凝胶在扫描仪上所占的区域，点击“开始”以启动扫描。

结果

图1. 使用红外荧光染料标记寡核苷酸的fEMSA实验。 (A) fEMSA实验流程图。(B) 溴酚蓝染料、橙G和dI-dC（1 µg）对fEMSA的影响。使用5 nM的5'染料标记LIM-4/SOX-2探针。(C) fEMSA显示6xHis-SOX-2^G73E与LIM-4/SOX-2元件中SOX-2靶位点的结合特异性。使用5 nM的5'染料标记LIM-4/SOX-2探针。LIM-4/SOX-2(M)为突变靶位点。凝胶在电泳后20分钟和40分钟进行扫描。电泳后40分钟获得的扫描图像用于定量荧光条带强度，并以未加冷探针泳道的强度为基准进行归一化。AU，任意单位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1	伯乐（Bio-Rad）	1610158	丙烯酰胺具有毒性和危害性。
牛血清白蛋白 分子生物学级	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700标记的DNA寡核苷酸	Integrated DNA Technologies	定制DNA寡核苷酸	这些在文稿中被称为5'端标记染料或红外荧光染料标记的DNA寡核苷酸。该公司将定制合成5'端IRDye标记的DNA寡核苷酸。最低需100条μM级合成与HPLC纯化。
Mini-PROTEAN 垂直电泳槽	伯乐（Bio-Rad）	1658000FC	设备
Odyssey CLx 近红外成像系统	LI-COR 生物技术	Odyssey CLx 近红外成像系统	设备
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR 生物技术	Odyssey Fc 双模式成像系统	设备
Image Studio 软件（版本 4.0）	LI-COR 生物技术	Image Studio 软件	软件
橙G	Sigma-Aldrich	O3756-25G	化学
6x 橙色上样染料			0.25% 橙黄G；30% 甘油
0.5x TBE			45 mM Tris-硼酸盐；1 mM EDTA
1× TE缓冲液			10 mM Tris-HCl；1 mM EDTA，pH 8.0
1x STE			100 mM NaCl；10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA
5×结合缓冲液			50 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM NaCl；200 mM KCl；5 mM MgCl₂；5 mM EDTA，pH 8.0；5 mM DTT；250 μg/mL BSA