染色质免疫沉淀法鉴定基因组DNA上靶蛋白结合位点

摘要

来源：Dong, X., 等.，通过低细胞量染色质免疫沉淀测序分析在急性纯化的PDGFRα+细胞中鉴定转录因子Olig2的基因组结合位点 J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了染色质免疫沉淀技术，用于鉴定少突胶质前体细胞基因组DNA特定区域上的蛋白质结合位点 通过 蛋白质结合的染色质片段的选择性免疫沉淀。该方法有助于研究多种调控蛋白的相互作用，包括参与基因调控的转录因子。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 从小鼠脑中纯化 PDGFRα 阳性少突胶质细胞谱系细胞（改良自先前描述的免疫平皿分离方案）

1. 用于PDGFRα阳性细胞筛选的免疫平皿制备，以及用于去除内皮细胞和小胶质细胞的两个平皿的制备。
   注意：请注意，免疫平皿实验需使用培养皿（Petri dishes），而非细胞培养皿；若纯化的细胞将用于后续培养，则免疫平皿操作必须在生物安全柜中进行
   1. 在4 °C条件下，将30 µL山羊抗大鼠IgG溶于10 mL pH 9.5、50 mM Tris-HCl缓冲液中，过夜包被一个10 cm培养皿。轻轻振荡培养皿，确保包被液均匀且完全覆盖皿表面。
   2. 将40 µL大鼠抗PDGFRα抗体加入含0.2% BSA的12 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，配制PDGFRα抗体溶液。
   3. 用10 mL 1× DPBS对IgG包被的培养皿洗涤3次后，在室温下用PDGFRα抗体溶液孵育4小时。
   4. 用10 mL 1× DPBS对大鼠抗PDGFRα抗体包被的培养皿洗涤3次。沿培养皿侧壁轻柔加入DPBS溶液，避免扰动包被表面。
   5. 用含2.3 µg/mL Banderiaea simplicifolia 凝集素1（BSL-1）的20 mL DPBS对两个新的15 cm培养皿进行包被，处理2小时，以去除内皮细胞和小胶质细胞。
   6. 用20 mL 1× DPBS对BSL-1包被的培养皿洗涤3次。沿培养皿侧壁轻柔加入DPBS溶液，避免扰动包被表面。
2. PDGFRα阳性少突胶质细胞系细胞的纯化方法基于先前发表的方法进行改进。
   1. 根据先前发表的方案，分离出生后第7天（P7）的两只小鼠的皮质组织。
   2. 使用神经组织解离试剂盒（P）按照制造商详细说明将组织解离为单细胞悬液。
   3. 简要而言，用解剖刀将分离的皮质组织切碎，并在37 °C下进行酶消化。消化完成后，使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管手动将组织块解离为单细胞悬液。
   4. 在室温下以300 × g离心单细胞悬液10分钟，弃上清，用15 mL免疫平皿缓冲液重悬细胞沉淀（免疫平皿缓冲液为含0.02% BSA和5 µg/mL胰岛素的DPBS）。
   5. 将来自两只小鼠脑组织的单细胞悬液依次在两个BSL-1包被的培养皿上孵育15分钟，室温下每5分钟轻柔振荡一次，以更有效地去除小胶质细胞和内皮细胞。
   6. 轻柔旋转培养皿收集未贴壁的细胞悬液，并将其转移至大鼠抗PDGFRα抗体包被的培养皿中，在室温下孵育45分钟。
   7. 细胞悬液在大鼠抗PDGFRα抗体包被的培养皿中孵育后，轻柔旋转培养皿收集细胞悬液，并用DPBS冲洗培养皿8次，以彻底去除未贴壁细胞。沿培养皿侧壁轻柔加入洗涤液，并轻轻振荡数次，确保未贴壁细胞被完全清除。
   8. 在37 °C下使用4 mL细胞解离液处理10分钟，使细胞从大鼠抗PDGFRα抗体包被的培养皿上脱落。轻轻摇动培养皿以促进贴壁细胞的释放。
   9. 在室温下以300 × g离心收集纯化的少突胶质前体细胞（OPCs），用2 mL OPC细胞培养基重悬细胞沉淀，并使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数（OPC培养基配方：DMEM/F12培养基500 mL，含青霉素-链霉素溶液（P/S）5 mL、N2添加剂5 mL、B27添加剂10 mL、胰岛素5 µg/mL、BSA 0.1%、bFGF 20 ng/mL和PDGFRα 10 ng/mL）。
3. 免疫平皿后OPCs纯度的验证。
   1. 为评估免疫平皿后OPCs的富集程度，取部分纯化的OPCs，根据制造商说明书，采用硫氰酸胍法提取RNA。
   2. 使用荧光绿色染料预混液进行qRT-PCR，检测纯化OPCs中PDGFRα表达水平的富集情况，并与解离的全脑细胞进行比较，参照先前发表的材料进行分析。
   3. 此外，将部分纯化的OPCs接种至多聚-D-赖氨酸包被的24孔板中，按照先前发表的方法，使用抗NG2硫酸软骨素蛋白聚糖（NG2）抗体进行免疫染色。

2. 低细胞量 ChIP 样品制备及高通量测序用 ChIP 文库构建

1. 使用市售的超声破碎系统和市售的低细胞数ChIP试剂盒（参见材料表），按照制造商提供的详细标准操作流程进行Olig2低细胞ChIP样品制备。
   1. 将细胞从包被了大鼠抗PDGFRα抗体的培养板上解离，并用台盼蓝和血细胞计数板进行细胞计数后，将20,000个纯化的少突胶质前体细胞（OPCs）置于1 mL OPC细胞培养基中，用于每轮ChIP反应。
   2. 向细胞悬液中加入27 µL 36.5%甲醛，在室温下固定10分钟。
      注意：出于安全考虑，甲醛必须在化学通风橱中使用。
   3. 加入50 µL 2.5 M甘氨酸，在室温下孵育5分钟，以终止DNA-蛋白质交联。
      注意：自此步骤起，所有操作均需在冰上或4 °C冷室中进行。
   4. 用含蛋白酶抑制剂混合物的1 mL冰上预冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤交联后的细胞沉淀，并在4 °C下以300 × g离心收集细胞。
   5. 在冰上用25 µL完全裂解缓冲液裂解细胞沉淀，持续5分钟。
      注意：轻轻振荡管子，使细胞充分悬浮于裂解缓冲液中。
   6. 向细胞裂解物中加入75 µL含蛋白酶抑制剂混合物的冰上预冷HBSS，并使用预冷的超声破碎系统对染色质进行剪切，程序为5个循环，每个循环30秒开启、30秒关闭。每次超声处理6个管子，确保平衡管中加入100 µL水。
   7. 剪切完成后，在4 °C下以14,000 × g离心10分钟，离心后将上清液转移至新管中。
   8. 取100 µL剪切后的染色质，加入等体积含蛋白酶抑制剂的冰上预冷完全ChIP缓冲液进行稀释。
   9. 保留20 µL稀释后的剪切染色质作为Input对照样品。
      注意：Input对照样品需与Olig2免疫沉淀样品进行比较，以识别由Olig2抗体特异性免疫沉淀的DNA片段。
   10. 向180 µL稀释后的剪切染色质中加入1 µL兔抗Olig2抗体，在4 °C下以40 rpm转速于旋转仪上孵育16小时。
       注意：此步骤应在冷室中进行。
   11. 对于每轮ChIP反应，用55 µL磁珠洗涤缓冲液洗涤11 µL蛋白A包被的磁珠两次，洗涤后将磁珠沉淀重悬于11 µL磁珠洗涤缓冲液中。
       注意：此步骤应在冷室中进行。
   12. 对于每轮ChIP反应，向ChIP反应管中加入10 µL预先洗涤过的蛋白A包被磁珠。此步骤应在冷室中进行。
   13. 将ChIP反应管在4 °C下继续于旋转仪上孵育2小时。
   14. 将ChIP反应管置于磁力架上静置1分钟。
       注意：此步骤应在冷室中进行。
   15. 小心移除上清液，避免扰动磁珠沉淀。
   16. 在4 °C下，分别用四种洗涤缓冲液各100 µL依次洗涤磁珠沉淀，每种缓冲液在旋转仪上孵育4分钟。
   17. 洗涤完成后，向磁珠沉淀中加入200 µL洗脱缓冲液，并在65 °C下孵育4小时，以逆转蛋白质-DNA交联。
   18. 同时，向20 µL Input对照样品中加入180 µL洗脱缓冲液，同样在65 °C下孵育4小时，以逆转蛋白质-DNA交联。
   19. 向每个ChIP反应管中加入200 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1, v/v）混合液。
   20. 剧烈涡旋1分钟，室温下以13,000 × g离心15分钟，将上层水相转移至新管中。
   21. 向每个ChIP反应管中加入40 µL 3 M乙酸钠溶液、1,000 µL 100%乙醇和2 µL共价连接蓝色染料的糖原沉淀剂，在-20 °C下过夜沉淀。
   22. 在4 °C下以13,000 × g离心20分钟。
   23. 弃去上清液，用500 µL预冷的70%乙醇洗涤一次，再在4 °C下以13,000 × g离心20分钟。
   24. 弃去上清液，将沉淀在空气中干燥10分钟，然后用50 µL水溶解沉淀。
2. 用于高通量测序的ChIP文库构建
   1. 根据制造商说明书，使用纯化试剂盒对ChIP DNA进行纯化和浓缩。
   2. 根据制造商说明书，使用PicoGreen法对ChIP样品进行定量。
   3. 根据制造商说明书，使用ChIP-seq试剂盒进行T尾添加、复制与尾部延伸、模板转换与延伸、接头连接与扩增、文库片段大小选择及纯化。
      1. 将双链DNA变性后，利用虾碱性磷酸酶去除单链DNA的3'端磷酸基团，并通过末端脱氧核苷酸转移酶在单链DNA上添加poly(T)尾。
      2. 将DNA poly(dA)引物与单链DNA模板退火，用于DNA复制和模板转换。
      3. 模板转换完成后，使用正向和反向引物通过PCR扩增ChIP-seq文库，以实现样本索引标记。
      4. 采用磁性微珠法（选项2）进行双轮大小选择，筛选出片段长度在250至500 bp之间的PCR扩增后ChIP-seq文库。
      5. 使用微流控芯片毛细管电泳装置检测所选ChIP-seq文库的质量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备
Banderiaea simplicifolia 凝集素 1	Vector Laboratories	# L-1100
大鼠抗PDGFRa抗体	BD Bioscience	# 558774
神经组织解离试剂盒（P）	MACS Miltenyi Biotec	# 130-092-628
Accutase	STEMCELL technologies	# 07920
TRIzol	Thermo Fisher	# 15596026
抗NG2硫酸软骨素蛋白聚糖抗体	Millipore	# AB5320
Bioruptor Pico超声破碎仪	Diagenode	# B01060001
True MicroChIP试剂盒	Diagenode	# C01010130
苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，v/v）	Thermo Fisher	# 15593031
NucleoSpin凝胶与PCR纯化试剂盒	MACHEREY-NAGEL	# 740609
Quant-iT PicoGreen dsDNA定量检测试剂盒	Thermo Fisher	# P11496
DNA SMART ChIP-Seq试剂盒	Clontech Laboratories	# 634865
Agencourt AMPure XP	Beckman Voulter	# A63880
GlycoBlue	Thermo Fisher	# AM9516
Pico-green	Thermo Fisher	# P11496
D-PBS	Thermo Fisher	# 14190-144
SYBR Green预混液	Bio-Rad Laboratories	# 1725124
DMEM/F12	Fisher Scientific	# 11-320-033
青霉素-链霉素（P/S）	Fisher Scientific	# 15140122
N-2添加剂	Fisher Scientific	# 17502048
B-27添加剂	Fisher Scientific	# 17504044
胰岛素	Sigma	# I6634	通过将5 mg胰岛素溶解于10 ml水并加入50 μl 1 N HCl，配制0.5 mg/ml胰岛素溶液。
牛血清白蛋白，适用于细胞培养（BSA）	Sigma	# A4161	通过将4 g BSA溶解于100 ml D-PBS中并调节pH至7.4，配制4% BSA溶液。
碱性成纤维细胞生长因子，人重组蛋白（bFGF）	EMD Millipore	# GF003
人PDGF-AA	VWR	# 102061-188
聚-D-赖氨酸	VWR	# IC15017510	通过将10 mg聚-D-赖氨酸溶解于10 ml水中，配制1 mg/ml聚-D-赖氨酸溶液，使用时稀释100倍。
Falcon一次性培养皿，无菌，Corning，100×15 mm	VWR	# 25373-100
Falcon一次性培养皿，无菌，Corning，150×15 mm	VWR	# 25373-187
HBSS，10×，无钙，无镁，无酚红	Fisher Scientific	# 14185-052
台盼蓝	Stemcell Technologies	# 07050
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	# 11697498001
qPCR所用引物名称			qPCR所用引物序列
Mbp-F:			CTATAAATCGGCTCACAAGG
Mbp-R:			AGGCGGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F:			ACTGCCAGCCTAAGACAACC
Iba1-R:			GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F:			GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R:			TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-F			ATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-R			CATACCAGGAAATGAGCTTG
Tuj1-F			TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-R			GATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-F			AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-R			GTCCCTCCACGGTACTCCT