利用荧光各向异性测定转录因子-DNA结合亲和力

摘要

来源：Jung, C. 等，利用荧光显微镜竞争性滴定法高灵敏度测定转录因子-DNA 结合亲和力。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了高灵敏度荧光各向异性技术，可用于监测转录因子与DNA之间的相互作用。该检测方法通过测量荧光标记DNA分子因分子旋转或荧光基团各向异性所产生的偏振程度，来监测荧光标记DNA分子与其特异性转录因子之间的相互作用。

方案

1. 偏振显微镜

1. 对于宽场激光照明，将连续波二极管激光器（40 mW）的638 nm谱线聚焦到多模光纤的孔径上以实现光束净化。在光纤输出端安装一个线性偏振器，以设定激光的偏振方向。
2. 使用二向色镜（640 nm截止）和带通滤光片（带通700/75）阻挡发射光中的激发成分。
3. 让荧光信号通过一个偏振分光棱镜，该棱镜将发射光分为相互垂直的偏振分量和平行偏振分量。然后，使用焦距为200 mm的消色差透镜，将非反射光束（平行分量）和反射光束（垂直分量）聚焦到背照式EM-CCD相机的芯片上（图1b和1c）。使用反射镜调节垂直分量光束的方向，使其对准透镜。

2. 荧光标记参考DNA寡核苷酸的设计与测试

1. 确定参考DNA的核心序列：该方法基于竞争性实验，通过测量转录因子与未标记的竞争性DNA寡核苷酸之间的解离常数（K_D2），该竞争性寡核苷酸会与荧光标记的DNA竞争结合转录因子，而荧光标记DNA对转录因子的亲和力作为参考（K_D1）。来自其他方法（如DNase足迹法或细菌单杂交实验）获得的共识序列可作为起始点。
   注意：通常情况下，合适的参考DNA与转录因子的结合亲和力相比共识序列应降低3至7倍。
2. 使用HiP-FA方法测定上一步推导出的共识序列中2-3个初步单点突变的K_D1值。尝试突变共识序列中特异性不强的位置，以避免完全丧失结合能力。
   注意：参考序列必须能够被目标转录因子（本实验方案中使用的是Giant Gt）结合，但结合不能过强，以便在高浓度下较弱的竞争性DNA仍能将其置换。
3. 将核心基序（通常为8-12个碱基对）通过在两侧添加对称的侧翼序列扩展至16个碱基对或更长（添加侧链以确保有效结合）。如有需要（例如针对较长的结合结构域），可使用更长的序列（HiP-FA实验中已测试过长达约50个碱基对的序列）。
   注意：需谨慎避免引入可能形成异位结合位点的碱基。可使用基于已有PWM模型预测结合位点的计算工具辅助设计（例如PySite）。
4. 作为标记的参考DNA，订购在正链或反链的3'端或5'端带有荧光标记的寡核苷酸。例如使用Cy5、Bodipy-650或其他合适的染料，配制成10 µM浓度（100 µM的10倍储备液）的水溶液，并按步骤3.1所述逐步稀释。
5. 通过在蒸馏水中加入33 mM磷酸钾缓冲液（pH = 7.0）、90 mM NaCl和0.01%非离子型去垢剂，配制500 mL的1x结合缓冲液。同时配制3x结合缓冲液，其成分相同，但浓度为三倍。若将3x结合缓冲液作为1x缓冲液的储备液，则配制体积应> 500 mL；否则配制250 mL。
   注意：该缓冲液组成已优化，以维持转录因子稳定性并防止谷胱甘肽S-转移酶（GST）发生二聚化。
6. 使用步骤1中所述的显微镜装置，在玻璃底96孔板中测定含有0.8 nM标记参考DNA的200 µL结合缓冲液在不同转录因子浓度下的荧光各向异性（FA）（设置5-6个不同转录因子浓度的孔），以确定实验所用的转录因子浓度。进行梯度滴定实验，随着转录因子浓度增加，选择曲线达到平台期时对应的浓度，表明参考DNA寡核苷酸已完全结合。
   注意：最佳转录因子浓度取决于转录因子-DNA解离常数的数值。通常，较低的K_D值需要使用较低的浓度。

3. 寡核苷酸退火

1. 为了退火标记的参考DNA的DNA寡核苷酸（序列由前一步确定），将7 µL的10 mM染料标记的单链正向DNA溶液与7 µL的10 mM未标记反向互补单链DNA溶液混合于186 µL水中。
2. 对于竞争DNA序列，将每种待测竞争序列的20 µL 100 mM正向单链DNA溶液（以水配制，由生产商提供）与20 µL 100 mM对应的反向单链DNA溶液混合。
3. 在标准PCR仪中分别进行退火：将溶液加热至70 °C保持3分钟，然后以0.1 K/s的速率降温至室温。若所用PCR仪不支持该降温速率，可采用分步梯度降温（已验证方案为99个循环，每个循环降温0.4 K，持续3秒）。

4. 凝胶制备

注意：以下部分介绍两种不同类型凝胶的制备方法：1）滴定孔中包含含有蛋白质的凝胶，用于测定相应竞争性DNA序列的K_D值；2）校准孔利用NB来确定在每个给定时间点和采集高度下的DNA浓度。重点是在96孔板中进行实验的准备，但也提供了适用于384孔板格式的相应体积。

1. 将0.5% w/v低熔点琼脂糖溶于结合缓冲液中，在实验室微波炉中加热至完全溶解。完全溶解后，用ddH₂O重新调整体积，以补偿可能发生的蒸发损失。
   注意：为方便起见，可预先配制10–20份、每份10 mL的凝胶储备液，并在需要时于75°C下融化使用。凝胶储备液可在室温下保存。
   注意：微波炉加热时需小心避免溶液过热。建议采用短时间多次加热，并在加热间期轻轻振荡。
2. 为制备滴定孔和校准孔，首先在75°C下振荡融化两份10 mL的凝胶储备液。
   1. 每种竞争子（n = 竞争子序列的数量）使用240 µL（包含20%余量）。
   2. 非结合（NB）校准孔使用相同体积的凝胶，以确保两种凝胶具有相同的温度和黏度。
   3. 随后将温度调至35°C，并等待温度平衡。
3. 对于滴定孔，加入1.4 nM（终浓度）杂交参考DNA（来自步骤3）、转录因子蛋白（终浓度CTF = 20–60 nM，根据步骤2.6确定）、DTT（0.2 mM）以及结合缓冲液，总体积分别为n × 200 µL（96孔板）或n × 13 µL（384孔板）（另加余量）。通过倒置或振荡充分混匀（切勿涡旋）。
4. 将上一步制备的凝胶溶液缓慢加入孔板的滴定孔中，96孔板每孔加200 µL，384孔板每孔加13 µL。
5. 对于校准孔，首先在孔外将5 nM NB加入已融化的凝胶中（总体积取决于所用孔板格式及校准孔数量；通常每块板5–6个校准孔即可）。
6. 将含NB的凝胶缓慢移取至孔板的滴定孔中，96孔板每孔200 µL，384孔板每孔13 µL，并确保避免产生气泡。
   注意：使用电子移液器或自动化机器人可显著提高实验重复性。
7. 在室温下静置10分钟使凝胶固化，再于4°C继续固化10分钟（必要时随后去除玻璃表面的冷凝水）。所有步骤均需在完全水平的表面上进行，以避免凝胶表面不均。
   注意：含蛋白的凝胶在4°C下通常可稳定保存至少数小时。

5. 加入竞争性 DNA 溶液

注意：以下溶液应在开始滴定前配制，并同时加入校准孔和滴定孔中。

1. 将退火标记的参照DNA和蛋白加入3倍浓度的结合缓冲液中，其浓度为凝胶储备溶液的3倍。
   1. 取20 µL所得溶液，与步骤3中获得的每种退火竞争DNA溶液各40 µL混合。
   2. 对于每个校准孔，将含15 mM NB溶液的20 µL 3倍浓度结合缓冲液与40 µL退火竞争DNA（任何相同长度的序列均可）混合。
      注意： 对于384孔板，总体积改用21 µL代替60 µL。
2. 可选：使用多孔板读板仪在380 nm处测定吸光度，通过光谱法检查板上各孔凝胶高度水平的均一性（吸光度值与凝胶高度成正比）。
3. 在凝胶上方加入50 µL（384孔板格式为7 µL）混合的竞争DNA溶液（在步骤3中已退火）。如有可能，使用电子多通道移液器或96通道移液头，尽可能同时加入所有竞争溶液。加入竞争溶液后，立即将板置于显微镜载物台上并立即开始测量。

6. 图像采集

1. 依次获取 z 轴堆叠图像的时间序列（例如，使用 12 个层面，光照时间为 100–300 ms）。避免在靠近孔板表面的位置采集图像< 约1.4 µm（使用本实验中的载玻片）以排除任何偏振偏差。
2. 进行10至25轮测量循环，直至标记的参照DNA完全从转录因子（TF）上解离。终点通常在1至2小时后达到，具体时间取决于竞争性DNA的结合动力学及其扩散能力。

结果

图 1：HIP-FA 检测法与实验装置的示意图。（a）用于在单个孔中滴定竞争性 DNA 的凝胶递送系统。（b）HIP-FA 显微镜装置。定制的自动化宽场显微镜，配备在 EM-CCD 相机上的偏振荧光检测系统。（c）原始荧光图像，其中两个感兴趣区域用于测定平行（红色）和垂直（绿色）偏振组分。（d）96 孔板的典型布局。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cy5标记的16-/18-bp DNA寡核苷酸	Eurofins		定制合成
16-/18-bp DNA寡核苷酸	Eurofins		定制合成
尼罗蓝A	Sigma	N5632-25G
Sensoplate plus 微孔板，96孔或384孔，PS材质	Greiner	655891
384孔Sensoplate，黑色	Greiner	788896
低凝胶温度琼脂糖	Sigma	A9414-50G
氯化钠 	Merck 	1.06404.1000
Tween-20 	Sigma 	P1379-1L
三水合二磷酸氢二钾	Merck 	1.05099.1000
磷酸二氢钾	Merck	1.04873.1000
Q-POD Element	Merck Millipore	ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold 滤器	Merck Millipore	MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 水纯化系统	Merck Millipore	ZRXQ003WW
Quantum TIX	Merck Millipore	QTUMOTIX1
DL-二硫苏糖醇	Sigma	43815-1G
Mastercycler gradient	Eppendorf	Z316083
SafeSeal 管，1.5 mL	Sarstedt	72.706.200
15 mL 管	Sarstedt	62.554.502
Multiply-Pro 杯，0.2 mL PP材质	Sarstedt	72.737.002
<strong>显微镜系统设置：</strong>
自动化宽场显微镜	LEICA	DMI6000
长距离物镜	LEICA	HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm连续波二极管激光器	Omicron	PHOxX 638-40, 40mW
背照式EM-CCD相机	Andor	iXon DV897
二向色镜	AHF	640nm截止
带通滤光片	AHF	ET带通 700/75
线性偏振片	Thorlabs	LPVISC050-MP2
偏振分束器	Thorlabs	BS010
消色差透镜	Thorlabs	200 mm焦距
多模光纤	Optronis	FVP600660710
<strong>机器人系统：</strong>
我们的机器人系统包括配备96通道头和Span-8移液器的Biomek NXP工作站，通过伺服穿梭装置连接，用于所有液体转移步骤。此外，系统还配备了由Span-8夹具操作的轨道摇床和微孔板读板仪（Paradigm，Molecular Devices）	Beckman Coulter	Biomek NXP
<strong>软件：</strong>
编程语言	National Instruments	Labview 9.0
HiP-FA软件脚本可从以下地址获取			https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA