研究目的基因翻译调控的报告基因抑制实验

摘要

来源：Katz, N.，等。一种用于定量测定细菌中蛋白质-RNA 结合的实验方法。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了一种 体内 在细菌中进行的用于研究RNA结合蛋白（RBPs）与RNA相互作用的检测。将两种质粒构建体转化至细菌细胞中——一种为结合位点质粒，编码在RBP结合位点下游含有荧光报告基因的mRNA；另一种为RBP质粒，在诱导剂调控下表达RBP蛋白。当通过诱导剂增加RBP的表达时，RBP结合到mRNA上，导致报告基因的翻译受到抑制 通过 抑制核糖体结合

方案

1. 系统准备

1. 结合位点质粒的设计
   1. 如图所示设计结合位点盒 图1每个微基因包含以下部分（5'至3'）：Eagl限制性酶切位点， ∼卡那霉素（Kan）抗性基因5'端的40个碱基、pLac-Ara启动子、核糖体结合位点（RBS）、mCherry基因的AUG、一段间隔序列δ），一个RBP结合位点，mCherry基因5'端的80个碱基，以及一个ApaLI限制性酶切位点。
      注意： 为提高检测的成功率，针对每个结合位点设计三个结合位点盒式结构，其间隔序列分别包含至少一个、两个和三个碱基。更多指导原则请参见代表性结果部分。
2. 结合位点质粒的克隆
   1. 订购结合位点盒式结构为双链DNA（dsDNA）微基因。每个微基因均为 ∼500 bp 长，5' 和 3' 末端分别含有 Eagl 限制性酶切位点和 ApaLI 限制性酶切位点（见步骤 1.1.1）。
      注意： 在本实验中，订购了包含一半卡那霉素基因的迷你基因，以方便对阳性菌落进行筛选。然而，此处也可采用吉布森组装法（Gibson assembly），此时可将结合位点设计为两条较短的互补单链DNA寡核苷酸进行订购。
   2. 使用Eagl-HF和ApaLI按照限制性酶切方案对迷你基因和目标载体进行双酶切，并通过柱纯化。
   3. 将消化后的微基因连接至含有mCherry报告基因其余部分、终止子及卡那霉素抗性基因的结合位点骨架上。
   4. 将连接反应液转入 大肠杆菌 TOP10细胞
   5. 通过Sanger测序鉴定阳性转化子。
      1. 在目标区域上游100个碱基处设计引物（参见 表1 引物序列）。
      2. 挑取几个细菌菌落进行质粒小提。
      3. 准备 5 µ5 mM 引物溶液的 L 和 10 µL 的 DNA，浓度为 80 ng/µL 浓度。
      4. 将两种溶液送至合适的机构进行Sanger测序。
   6. 将纯化的质粒在 -20 ℃ 保存 °C，以及以96孔板形式保存的细菌菌株甘油菌，随后将DNA用于转化 E. coli 含有四种融合型RBP质粒之一的TOP10细胞（参见步骤1.3.5）。
3. RBP 质粒的设计与构建
   注意： 本研究中所用衣壳蛋白的氨基酸和核苷酸序列列于 表 2.
   1. 订购所需的RBP序列（不含终止密码子），作为定制的双链DNA微基因，两端带有限制性酶切位点，且不含终止密码子（图1).
   2. 将待测的RBP（不含终止密码子）克隆至诱导型启动子的下游，并位于一个不含起始密码子的荧光蛋白的上游图1），与步骤 1.2.2–1.2.4 类似。确保 RBP 质粒所含的抗生素抗性基因与结合位点质粒不同。
   3. 通过Sanger测序鉴定阳性转化子，方法类似于步骤1.2.5（参见 表1 引物序列）。
   4. 选择一个阳性转化子并制备成感受态细胞。将纯化的质粒以甘油保存于-20℃ °C 和细菌菌株的甘油冻存于 -80 °C，置于96孔板中。
   5. 将步骤1.2.6中保存在96孔板中的结合位点质粒转化至已含有RBP-mCerulean质粒的化学感受态细菌细胞中。为节省时间，无需将细胞接种于培养皿，而是使用8通道移液器将细胞接种于含有Luria-Bertani（LB）琼脂及相应抗生素（Kan和Amp）的8道板上。菌落应在16小时后出现。
   6. 为每个双转化子挑选单菌落，加入含相应抗生素（Kan 和 Amp）的 LB 培养基中过夜培养，并于 -80 ℃ 以甘油保存液形式保存 °C，置于96孔板中。

2. 实验设置

注意： 本方案使用液体处理机器人系统，结合培养箱和酶标仪完成。每次测量包含24种诱导剂浓度，每种菌株与诱导剂的组合均设两个重复。利用该机器人系统，每天可完成16株菌、每株24种诱导剂浓度的数据采集。然而，若无此类设备，或实验规模较小，则可使用八通道多通道移液器手动操作，并相应调整方案。例如，初步实验即采用此手动方法，每天检测4株菌，每株使用12种诱导剂浓度，并设置4个时间点。

1. 提前配制 1 L 生物测定缓冲液（BA）：将 0.5 g 胰蛋白胨、0.3 mL 甘油、5.8 g NaCl、50 mL 1 M MgSO₄、1 mL pH 7.4 的 10 倍磷酸盐缓冲液（PBS）和 950 mL 双蒸水（DDW）混合。对 BA 缓冲液进行高压灭菌或无菌过滤。
2. 在 48 孔板中，于 37 °C、250 rpm 振荡条件下，在 1.5 mL 含适当抗生素（卡那霉素终浓度为 25 μg/mL，氨苄青霉素终浓度为 100 μg/mL）的 LB 培养基中培养双转化菌株，培养 18 小时（过夜）。
3. 早晨进行以下准备工作。
   1. 诱导剂板。在洁净的 96 孔板中，于 37 °C 培养箱中准备含半贫培养基（SPM）的孔，SPM 由 95% BA 和 5% LB26 组成。孔的数量应与所需诱导剂浓度数量相对应。向诱导剂板中将含有最高诱导剂浓度（218 nM）的孔中加入 C4-HSL。
   2. 编程机器人将每个最高浓度孔中的培养基依次稀释至 23 个较低浓度，浓度范围为 0 至 218 nM。每种诱导剂稀释液的体积应足以满足所有菌株（包括重复样）的需要。
   3. 在进行诱导剂稀释的同时，将 96 孔板中的 180 μL SPM 在 37 °C 培养箱中预热。
   4. 通过连续稀释将第 2.2 步中的过夜培养菌液稀释 100 倍：首先，在 48 孔板中将 100 μL 菌液与 900 μL SPM 混合，进行 10 倍稀释；然后，在适合荧光检测的 96 孔板中，取 20 μL 上述稀释液加入 180 μL 预热的 SPM 中，再次稀释 10 倍。
   5. 根据最终浓度，将诱导剂板中的稀释诱导剂加入含有稀释菌液的 96 孔板中。
4. 将 96 孔板在 37 °C 振荡培养 6 小时，每隔 30 分钟使用酶标仪测定 595 nm 处的光密度（OD595）、mCherry 荧光（560 nm/612 nm）和 mCerulean 荧光（460 nm/510 nm）。为归一化目的，同时测定未接种细胞的 SPM 的生长情况。

结果

图1：系统设计与克隆步骤概览。 结合位点质粒（左侧）和RBP-mCerulean质粒（右侧）的盒式结构示意图。下一步是将两种质粒依次转化至感受态E. coli细胞中，先转化RBP质粒。随后检测双转化子在诱导剂浓度递增条件下的mCherry表达水平；若RBP与结合位点结合，则mCherry水平将随mCerulean表达量增加而下降（灰色气泡）。

表1：结合位点与测序引物。 本研究中使用的结合位点及结合位点盒的序列，以及本方案中所述测序反应所用的引物序列（步骤1.2.5.1和1.3.3）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素钠盐	SIGMA	A9518
硫酸镁（MgSO4）	ALFA AESAR	33337
48孔板	Axygen	P-5ML-48-C-S
8通道板	Axygen	RESMW8I
96孔板	Axygen	P-DW-20-C
用于酶标仪的96孔板	Perkin Elmer	6005029
ApaLI	NEB	R0507
结合位点序列	Gen9 Inc. 和 Twist Bioscience		见表1
<em>E. coli</em> TOP10细胞	Invitrogen	C404006
Eagl-HF	NEB	R3505
甘油	BIO LAB	71205
培养箱	TECAN	Liconic incubator
硫酸卡那霉素	SIGMA	K4000
KpnI-HF	NEB	R0142
连接酶	NEB	B0202S
液体处理机器人系统	TECAN	EVO 100, MCA 96通道
MATLAB分析软件	Mathworks
8通道多通道移液器	Axygen	BR703710
N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯（C<sub>4</sub>-HSL）	Cayman	K40982552 019
PBS缓冲液	Biological Industries	020235A
酶标仪	TECAN	Infinite F200 PRO
Q5 HotStart聚合酶	NEB	M0493
RBP序列	Addgene	27121 &amp; 40650	见表2
氯化钠（NaCl）	BIO LAB	190305
SV凝胶和PCR纯化系统	Promega	A9281
胰蛋白胨	BD	211705