改良的酵母单杂交法检测异源蛋白复合物-DNA相互作用

摘要

来源：Tripathi, P. 等，一种用于异源蛋白复合物- DNA 相互作用研究的改良酵母单杂交系统。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们展示了改良的酵母单杂交实验方法，该方法可用于检测多种蛋白质与靶DNA的相互作用。转化后的酵母细胞在报告基因上游含有靶DNA序列，同时表达转录因子蛋白。当这些蛋白形成复合物并结合到靶DNA上时，报告基因将被表达，并可通过酶学方法进行检测。

方案

1. 第9天（上午）：开始培养以进行酶活性测定。

1. 使用多通道移液器将培养物重悬，并转移125 μL至分光光度计检测板中（测定OD₆₀₀）。
   注意：注意：避免排出最后一滴液体，以防产生气泡；若OD₆₀₀低于0.3–0.6，则根据读数将剩余细胞继续培养1–2小时。此步骤中使用的125 μL培养物可根据用户意愿弃去或重新转移回原始深孔块中。
2. 将深孔块中的剩余细胞在3000 × g、21 °C条件下离心10分钟，通过倒置去除上清液。
3. 加入200 μL Z缓冲液并涡旋振荡。
   注意：Z缓冲液的配方详见表1。
4. 在3000 × g、21 °C条件下离心5分钟，通过倒置去除上清液。
5. 加入20 μL Z缓冲液并涡旋振荡。
6. 用可耐受冻融循环的密封膜覆盖板孔，在通风橱中使用液氮进行4次冻融循环（每次2分钟，先在液氮中冷冻，再于42 ºC水浴中解冻）。
7. 加入200 μL Z缓冲液/β-巯基乙醇（β-ME）/邻硝基苯基-β-半乳糖苷（ONPG）混合液（分别加入12 mL、21 μL和8.4 mg可配制20 mL溶液；请现配现用）。
   注意：ONPG溶解需要一定时间，建议在此步骤前1小时配制该溶液。ONPG作为底物用于β-半乳糖苷酶活性的测定。
8. 在30 °C下孵育最多17–24小时（期间定期观察，若颜色提前显现，则进入下一步）。

2. 第10天（上午）：终止反应并进行测量。

1. 加入 110 μL 1M Na₂CO₃ 以终止反应，并记录时间。
2. 涡旋混匀后，在 3000 × g 条件下于 21 °C 离心 10 分钟。
3. 使用多通道移液器吸取 125 μL 上清液，并测定 OD₄₂₀。
   注意：注意不要排出最后一滴液体，以免产生气泡。

表1： 本实验方案中所用溶液的配制方法。 该表格列出了检测中主要缓冲液的储存液和工作液的配制方法。

TE缓冲液10X（10 ml）
理想的	从储备液
1000 mM Tris-Cl（pH 8.0）	1 mL Tris 1 M
10 mM EDTA（pH 8.0）	200 μL 0.5 M EDTA
加水至所需体积
TE/LiAc（10 ml）
理想的	从储备液
1X	1 mL TE 缓冲液（10×）
0.1 M LiAc	1 mL LiAc 1 M
加水至所需体积
TE/LiAc/PEG（50 mL）50%
理想的	从储备液
1X	5 mL TE 10X
0.1 M LiAc	5 mL 1 M LiAc
40 mL PEG3350
Z缓冲液（1升），pH 7.0
Na2HPO4，七水合物16.1克或无水物8.52克
NaH2PO4 5.5克水合物或4克无水物
KCl 0.75 g
MgSO₄4 0.246克水合物或0.12克无水物
用 HCl 维持 pH
所有溶液在使用前均需灭菌。
本方案中使用的培养基和琼脂平板（YPDA、SD-Ura；SD-Trp-Ura 和 SD-Trp-Ura 琼脂平板）的配方与 Y1H 中所用相同

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔圆底板	Greiner bio-one	650101	塑料器皿
96深孔板	USA Scientific	1896-2000	塑料器皿
可密封铝箔	USA Scientific	2923-0110	塑料器皿
Araseal	Excel Scientific	B-100	塑料器皿
2-巯基乙醇	Fisher Scientific	034461-100	检测
ONPG	Sigma-Aldrich	73660	检测
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223484	检测
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	检测
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139	检测
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	检测
MgSO4	Sigma-Aldrich	83266	检测
HCl	Fisher Scientific	SA54-4	检测
干式恒温器	Thermo Fischer		设备
涡旋振荡器	Thermo Fischer		设备
离心机	Eppendorf	Centrifuge 5810R	设备
酶标仪	Molecular Device	SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer	设备
培养箱	Thermo Fisher	型号 5250-37摄氏度，6250-30摄氏度	设备
摇床培养箱	New Brunswick		设备
水浴锅	Thermo Fisher	IsoTemp 205	设备
Tris碱	Fisher Scientific	BP152-1	检测