改良的酵母单杂交法检测异源蛋白复合物-DNA相互作用

摘要

来源：Tripathi, P. 等，一种用于异源蛋白复合物- DNA 相互作用研究的改良酵母单杂交系统。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们展示了改良的酵母单杂交实验方法，该方法可用于检测多种蛋白质与靶DNA的相互作用。转化后的酵母细胞在报告基因上游含有靶DNA序列，同时表达转录因子蛋白。当这些蛋白形成复合物并结合到靶DNA上时，报告基因将被表达，并可通过酶学方法进行检测。

方案

1. 第9天（上午）：开始培养以进行酶活性测定。

1. 使用多通道移液器将培养物重悬，并转移125 μL至分光光度计检测板中（测定OD₆₀₀）。
   注意：注意：避免排出最后一滴液体，以防产生气泡；若OD₆₀₀低于0.3–0.6，则根据读数将剩余细胞继续培养1–2小时。此步骤中使用的125 μL培养物可根据用户意愿弃去或重新转移回原始深孔块中。
2. 将深孔块中的剩余细胞在3000 × g、21 °C条件下离心10分钟，通过倒置去除上清液。
3. 加入200 μL Z缓冲液并涡旋振荡。
   注意：Z缓冲液的配方详见表1。
4. 在3000 × g、21 °C条件下离心5分钟，通过倒置去除上清液。
5. 加入20 μL Z缓冲液并涡旋振荡。
6. 用可耐受冻融循环的密封膜覆盖板孔，在通风橱中使用液氮进行4次冻融循环（每次2分钟，先在液氮中冷冻，再于42 ºC水浴中解冻）。
7. 加入200 μL Z缓冲液/β-巯基乙醇（β-ME）/邻硝基苯基-β-半乳糖苷（ONPG）混合液（分别加入12 mL、21 μL和8.4 mg可配制20 mL溶液；请现配现用）。
   注意：

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔圆底板	Greiner bio-one	650101	塑料器皿
96深孔板	USA Scientific	1896-2000	塑料器皿
可密封铝箔	USA Scientific	2923-0110	塑料器皿
Araseal	Excel Scientific	B-100	塑料器皿
2-巯基乙醇	Fisher Scientific	034461-100	检测
ONPG	Sigma-Aldrich	73660	检测
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223484	检测
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	检测
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139	检测
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	检测
MgSO4	Sigma-Aldrich	83266	检测
HCl	Fisher Scientific	SA54-4	检测
干式恒温器	Thermo Fischer		设备
涡旋振荡器	Thermo Fischer		设备
离心机	Eppendorf	Centrifuge 5810R	设备
酶标仪	Molecular Device	SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer	设备
培养箱	Thermo Fisher	型号 5250-37摄氏度，6250-30摄氏度	设备
摇床培养箱	New Brunswick		设备
水浴锅	Thermo Fisher	IsoTemp 205	设备
Tris碱	Fisher Scientific	BP152-1	检测