使用生物素标记的RNA双链体测定靶蛋白的解旋酶活性

摘要

来源：Yu, L. 等，利用生物素标记在体外生化实验中研究蛋白质-核酸相互作用。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了检测目标蛋白解旋酶活性以解旋生物素标记的双链RNA底物的实验步骤。通过分析电泳迁移率变化，并结合使用化学发光酶偶联链霉亲和素进行化学发光检测，来鉴定该酶的活性。

方案

1. 蛋白质制备

1. MOV10 表达载体
   1. 构建编码小鼠 MOV10 的 cDNA 表达载体。
      1. 为每个片段设置聚合酶链式反应（PCR）反应。混合 1 μ小鼠cDNA（来自C57BL/6小鼠睾丸），1 L μdNTP 溶液，2 L μ10 升 μM 正向引物，2 μ10 升 μM 反向引物，1 μL DNA聚合酶，25 μ2× PCR 缓冲液 L，以及 18 μ双蒸水 L₂O (ddH₂O)₂O）定容至 50 μL.
         注意： 用于扩增的引物 Mov10 基因片段列于 表1.
      2. 使用以下程序进行PCR反应：95 °C 5分钟，35个循环：95℃加热 °C，退火 64℃ 15 秒 °C，15 秒；72 ℃延伸 °C，20 秒（扩增长片段 MOV10 时为 2 分钟），最后在 68 °7 分钟，4 ℃
   2. 通过凝胶电泳分析扩增的PCR DNA，在紫外灯下迅速切下凝胶中所需大小的条带，并将其放入离心管中。 
      注意： 在琼脂糖凝胶上可见的 MOV10 预期产物大小为 3015 bp。
   3. 使用凝胶回收试剂盒，按照生产商说明书纯化PCR产物DNA。
      1. 加入等体积的溶解缓冲液至步骤1.1.2中的离心管，并在50–55 °在 50 °C 水浴中孵育 5–10 分钟，确保凝胶完全融化。短暂离心，收集管壁上的液滴。   
         注意： 凝胶和溶解缓冲液的质量/体积浓度为 1 mg/μL.
      2. 将吸附柱放入收集管中，将含有溶解凝胶片段的溶液转移至吸附柱中，于12,000 × g离心 x g 2 分钟。
      3. 弃去收集管底部的滤液。加入 600 μ将 L 洗涤缓冲液加入柱中，于 12,000 离心 x g 1 分钟，弃去滤液。
      4. 重复步骤 1.1.3.3 一次。
      5. 将柱子放回收集管中，于12,000 × g离心 x g 2分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液。
      6. 将吸附柱置于一个1.5 mL无菌离心管中，加入50 μddH₂O 的升₂O至吸附柱中心，于12,000离心 x g 孵育1分钟。使用分光光度计测定洗脱液的DNA浓度。
   4. 质粒的限制性消化
      1. 用BamHI和XhoI酶切pRK5载体，通过混合4 μpRK5 载体 5 克 μ10倍消化缓冲液，1 L μL 的 BamHI，以及 1 μXhoI 和 ddH 的 L₂O 至终反应体积为 50 μL. 37℃孵育 °2小时，C
   5. 通过凝胶电泳分析载体DNA，在紫外灯下用手术刀迅速切下凝胶中目标大小的条带，并将其放入离心管中。
   6. 使用凝胶回收试剂盒按照制造商说明书纯化载体DNA，步骤见1.1.3。         
   7. 将0.03 pmol线性化载体、0.06 pmol cDNA片段和2混合，建立标准的重组连接反应 μL 连接酶和 4 μ5x 连接酶缓冲液 L 和 ddH₂O₂O，最终反应体积为10 μL.
      注意： 将MOV10克隆至pRK5载体中。
   8. 在37℃下孵育混合物 °C 反应 30 分钟，然后立即在冰上冷却 5 分钟。将 MOV10 重组质粒转化至 DH5α 细菌
      注意： 通过Sanger测序验证所有重组构建体。
   9. 通过向液体培养物中加入等体积的50%甘油，制备含有经验证重组质粒的细菌甘油冻存液，并于-80℃保存 °C.         
      注意： 在每次后续实验中，从甘油菌种中划线接种细菌至新鲜的琼脂平板，然后按照步骤1.2所述，挑取单菌落进行扩增。
2. 从HEK293T细胞中提取的MOV10蛋白
   1. 在培养的 HEK293T 细胞中瞬时表达 MOV10 蛋白。
      1. 制备浓度为的 MOV10-pRK5 质粒 >500 ng/μL.
      2. 在15 cm培养皿中接种HEK293T细胞。当细胞密度达到约70%–90%时，将细胞培养基更换为含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的新鲜杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
      3. 一次转染时，将60 μg 的 MOV10-pRK5 质粒 DNA 溶于 3 mL 低血清培养基中，然后加入 120 μL 转染增强试剂，充分混匀。
      4. 在另一支试管中稀释90 μ将转染试剂与3 mL无青霉素-链霉素的低血清培养基混合，充分混匀。
      5. 将稀释后的DNA加入每管稀释的转染试剂中，室温孵育15分钟。
      6. 将转染混合物加入细胞培养物中，培养细胞约36–48小时。
   2. 36–48 小时后，从每块培养板中收集细胞至 50 mL 离心管中。在 500 × g 条件下离心 x g 4℃下5分钟 °C. 每个沉淀用10 mL预冷的PBS洗涤，500 × g离心收集细胞 x g 4℃下5分钟 °C.
   3. 将沉淀重悬于 3 mL 含有完全不含乙二胺四乙酸（EDTA）的蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液中。冰上孵育 30 分钟。将裂解液在 20,000 × g 离心 x g 和 4 °20 分钟，C
   4. 加入100 μ每皿细胞使用1.5 mL离心管中适量的抗FLAG磁珠。
   5. 用K150缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，150 mM KoAc，1 mM DTT，0.1% NP-40）将磁珠洗涤2次。
      1. 将磁珠重悬于1 mL预冷的K150缓冲液中。
      2. 将磁珠在 4℃ 孵育 2 分钟 °在轻轻旋转的条件下于 C 中孵育，并使用磁铁沉淀磁珠。移除并弃去上清液。
   6. 将磁珠加入步骤1.3.3的细胞裂解液上清中，4℃孵育 °2小时，4℃
   7. 用K150缓冲液将蛋白结合的磁珠洗涤3次，然后用含250 mM NaCl的K150缓冲液洗涤2次，再用K150缓冲液洗涤3次，步骤同1.3.5。
   8. 将珠子重悬于 300 μL FLAG 洗脱缓冲液（100 mM NaCl，20 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM MgCl₂）₂，10% 甘油），加入 FLAG 肽至终浓度为 0.5 μ克/μL，并在旋转仪上与珠子一起于4℃孵育 °在 4°C 下孵育 1 小时，然后使用磁铁收集磁珠。
   9. 收集含有洗脱的MOV10蛋白的上清液，测定浓度后于-80℃保存 °用于将来使用。

2. 核酸制备

1. 从合适的供应商处购买带或不带生物素标记的DNA和RNA寡核苷酸（oligos）。将每种寡核苷酸用无RNase的ddH₂O稀释至20 μM，并于-80 °C保存以备后续使用。
   注意：本研究中使用的DNA/RNA底物的寡核苷酸序列列于 表2中。
2. 为进行MOV10解旋酶活性测定中的双链RNA（dsRNA）退火反应，配制如下混合液：在终体积为20 μL的反应体系中，加入pH 7.5的60 mM N-2-羟乙基哌嗪-N-乙烷磺酸（HEPES）、6 mM KCl、0.2 mM MgCl₂以及无RNase的ddH₂O。
3. 通过将生物素标记的上链（终浓度2 μM）与1.5倍量未标记的互补下链在退火缓冲液（步骤2.2）中混合，于95 °C加热5分钟，然后缓慢冷却至室温（RT），使RNA寡核苷酸退火形成RNA双链结构。

3. 体外生化实验

1. 电泳迁移率变动分析（EMSA）和酶促反应
   1. 进行MOV10解旋酶活性检测时，在终体积为20 μL的反应体系中混合以下组分：pH 7.5的50 mM Tris-HCl、20 mM KoAc、2 mM MgCl₂、0.01% NP-40、1 mM DTT、2 U/μL RNase抑制剂、10 nM生物素标记的RNA底物、2 mM三磷酸腺苷（ATP）、100 nM RNA捕获序列（RNA trap）和20 ng MOV10蛋白，并用ddH₂O补足体积。将反应混合物在37 °C下分别孵育10分钟、30分钟和60分钟，随后加入5×终止缓冲液以终止反应。
      注意：RNA捕获序列是一种未标记生物素的寡核苷酸，其序列与标记的寡核苷酸互补，可防止解链后的双链RNA重新退火。
2. 聚丙烯酰胺凝胶制备
   1. 清洗玻璃板（16 cm × 16 cm）和1.5 mm厚的梳子，并组装电泳装置。
   2. 配制10%非变性聚丙烯酰胺凝胶：混合14 mL ddH₂O、1.25 mL 10×TBE缓冲液（Tris-硼酸-EDTA）、8.3 mL 30%丙烯酰胺溶液、1.25 mL 50%甘油、187.5 μL 10%新配制的过硫酸铵（APS）以及12.5 μL四甲基乙二胺（TEMED）。
   3. 配制20%非变性聚丙烯酰胺凝胶：混合5.5 mL ddH₂O、1.25 mL 10×TBE缓冲液、1.25 mL 50%甘油、16.7 mL 30%丙烯酰胺溶液、187.5 μL 10% APS以及12.5 μL TEMED。
   4. 立即倒入玻璃板之间，并插入梳子，室温下静置约30分钟使其充分聚合。
3. 凝胶电泳
   1. 取出梳子，并向电泳槽中加入电泳运行缓冲液（0.5×TBE）。
   2. 用0.5×TBE缓冲液冲洗加样孔，然后将凝胶置于冰浴中以100 V预电泳30分钟，之后更换为新鲜的0.5×TBE运行缓冲液。
   3. 每孔上样20–25 μL样品。
   4. EMSA实验使用10%非变性丙烯酰胺凝胶，酶促反应实验使用20%非变性丙烯酰胺凝胶。在冰浴条件下以100 V进行电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部四分之一处。 
4. 拆卸玻璃板，切除加样孔及未使用的泳道部分，将凝胶转移至0.5×TBE缓冲液中。
5. 将滤纸和尼龙膜裁剪至与凝胶相同大小，并用缓冲液预先润湿干净的滤纸和尼龙膜。
6. 组装转膜夹心结构
   1. 将预先润湿的尼龙膜放置在预先润湿的滤纸上。
   2. 将凝胶置于尼龙膜上。
   3. 在凝胶上方覆盖另一层预先润湿的滤纸。
   4. 用洁净的移液枪头从中心向边缘滚动，以去除所有气泡。
7. 在半干式电转仪中以90 mA电流将样品从凝胶转移至尼龙膜，持续20分钟。
8. 停止转膜后，将膜置于新的滤纸上干燥1分钟。
9. 使用配备254 nm紫外灯的紫外交联仪，在120 mJ/cm² 条件下照射45–60秒进行交联（使用自动交联功能），随后在室温下空气中干燥30分钟。
10. 化学发光检测
    1. 方案1：使用商品化化学发光核酸检测试剂盒的标准体积操作。
       1. 向膜中加入20 mL封闭缓冲液，在摇床上以20–25 rpm轻柔振荡孵育15–30分钟。
       2. 在20 mL封闭缓冲液中加入66.7 μL稳定化的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物，配制偶联物/封闭缓冲液工作液。
       3. 轻轻弃去封闭缓冲液，替换为偶联物/封闭缓冲液，继续在摇床上以20–25 rpm振荡孵育15分钟。
       4. 用缓冲液洗涤膜4次，每次在40–45 rpm下振荡5分钟。
       5. 向膜中加入30 mL底物平衡缓冲液，在20–25 rpm下振荡孵育5分钟。
       6. 将6 mL鲁米诺/增强剂溶液加入6 mL稳定过氧化物溶液中，配制成底物工作液。避光操作。 
       7. 用底物工作液完全覆盖膜表面，孵育5分钟。
       8. 在化学发光成像系统中扫描1–3秒以获取信号。

表1：用于PCR扩增基因的引物 Meiob 和 Mov10 的片段 正向和反向引物中的粗体字母为BamHI和NotI酶切位点；反向引物中斜体粗体字母为XhoI酶切位点；加框的粗体字母表示对应R235A点突变的核苷酸。

片段	引物	序列（从 5’ 到 3’）
MEIOB-A	正向	CGGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	反转	ATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C	正向	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
	反转	CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E	正向	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
	反转	CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut	正向	CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
	反转	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	正向	GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
	反转	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

表2：本研究中使用的DNA/RNA底物序列。

图	名称	序列（5' 至 3'）
图 2、5	36 nt 单链 DNA	5'-Biotin-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (DNA)
图 3	36 nt 单链 RNA	5'-Biotin-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3' (RNA)
图 4	54 nt 5'-末端带尾的双链 RNA	5'-Biotin-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA) 5'-ACGAGGGAGACGAGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA)

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
离心机	Eppendorf, Germany	5242R
化学发光成像系统	Tanon, China	5200
数字式超声波破碎仪	Branson, USA	BBV12081048A	450 瓦特；50/60 赫兹
半干式电泳转膜仪	Hoefer, USA	TE77XP
管式旋转混合器	Crystal, USA	3406051
紫外光交联仪	UVP, USA	CL-1000
材料
尼龙膜	Thermo Scientific, USA	TG263940A
TC处理培养皿	Corning, USA	430167	100 毫米
TC处理培养皿	Corning, USA	430597	150 毫米
微量离心管	AXYGEN, USA	MCT-150-C	1.5 毫升
离心管	Corning, USA	430791	15 毫升
试剂
抗FLAG M2磁珠	Sigma, USA	M8823
ATP	Thermo Scientific, USA	591136
BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒	Beyotime, China	C3206
CelLyticTM M细胞裂解试剂	Sigma, USA	107M4071V
ClonExpress II一步克隆试剂盒	Vazyme, China	C112
化学发光核酸检测试剂盒	Thermo Scientific, USA	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, USA	10569044
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G	0.5 M
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	Roche, USA	4693132001
EndoFree大提质粒试剂盒	Vazyme, China	DC202
FastPure凝胶DNA小提试剂盒	Vazyme, China	DC301-01
FBS	Gibco, USA	10437028
FLAG多肽	Sigma, USA	F4799
甘油	Sigma, USA	SHBK3676
HEPES缓冲液	Sigma, USA	SLBZ2837	1 M
KOAc	Sangon Biotech, China	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G	1 M
NaCl	Invitrogen, USA	AM9759	5M
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
Opti-MEM培养基	Gibco, USA	31985062
PBS	Gibco, USA	10010023	pH 7.4
RNase抑制剂	Promega, USA	N251B
链霉亲和素-碱性磷酸酶	Promega, USA	V5591
TBE	Invitrogen, USA	15581044
Tris-HCI缓冲液	Invitrogen, USA	15567027	1 M, pH 7.4
Tris-HCI缓冲液	Invitrogen, USA	15568025	1 M, pH 8.0
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560