使用生物素标记的RNA双链体测定靶蛋白的解旋酶活性

摘要

来源：Yu, L. 等，利用生物素标记在体外生化实验中研究蛋白质-核酸相互作用。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了检测目标蛋白解旋酶活性以解旋生物素标记的双链RNA底物的实验步骤。通过分析电泳迁移率变化，并结合使用化学发光酶偶联链霉亲和素进行化学发光检测，来鉴定该酶的活性。

方案

1. 蛋白质制备

1. MOV10 表达载体
   1. 构建编码小鼠 MOV10 的 cDNA 表达载体。
      1. 为每个片段设置聚合酶链式反应（PCR）反应。混合 1 μ小鼠cDNA（来自C57BL/6小鼠睾丸），1 L μdNTP 溶液，2 L μ10 升 μM 正向引物，2 μ10 升 μM 反向引物，1 μL DNA聚合酶，25 μ2× PCR 缓冲液 L，以及 18 μ双蒸水 L₂O (ddH₂O)₂O）定容至 50 μL.
         注意： 用于扩增的引物 Mov10 基因片段列于 表1.
      2. 使用以下程序进行PCR反应：95 °C 5分钟，35个循环：95℃加热 °C，退火 64℃ 15 秒 °C，15 秒；72 ℃延伸 °C，20 秒（扩增长片段 MOV10 时为 2 分钟），最后在 68 °7 分钟，4 ℃
   2. 通过凝胶电泳分析扩增的PCR DNA，在紫外灯下迅速切下凝胶中所需大小的条带，并将其放入离心管中。 
      

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
离心机	Eppendorf, Germany	5242R
化学发光成像系统	Tanon, China	5200
数字式超声波破碎仪	Branson, USA	BBV12081048A	450 瓦特；50/60 赫兹
半干式电泳转膜仪	Hoefer, USA	TE77XP
管式旋转混合器	Crystal, USA	3406051
紫外光交联仪	UVP, USA	CL-1000
材料
尼龙膜	Thermo Scientific, USA	TG263940A
TC处理培养皿	Corning, USA	430167	100 毫米
TC处理培养皿	Corning, USA	430597	150 毫米
微量离心管	AXYGEN, USA	MCT-150-C	1.5 毫升
离心管	Corning, USA	430791	15 毫升
试剂
抗FLAG M2磁珠	Sigma, USA	M8823
ATP	Thermo Scientific, USA	591136
BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒	Beyotime, China	C3206
CelLyticTM M细胞裂解试剂	Sigma, USA	107M4071V
ClonExpress II一步克隆试剂盒	Vazyme, China	C112
化学发光核酸检测试剂盒	Thermo Scientific, USA	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, USA	10569044
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G	0.5 M
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	Roche, USA	4693132001
EndoFree大提质粒试剂盒	Vazyme, China	DC202
FastPure凝胶DNA小提试剂盒	Vazyme, China	DC301-01
FBS	Gibco, USA	10437028
FLAG多肽	Sigma, USA	F4799
甘油	Sigma, USA	SHBK3676
HEPES缓冲液	Sigma, USA	SLBZ2837	1 M
KOAc	Sangon Biotech, China	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G	1 M
NaCl	Invitrogen, USA	AM9759	5M
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
Opti-MEM培养基	Gibco, USA	31985062
PBS	Gibco, USA	10010023	pH 7.4
RNase抑制剂	Promega, USA	N251B
链霉亲和素-碱性磷酸酶	Promega, USA	V5591
TBE	Invitrogen, USA	15581044
Tris-HCI缓冲液	Invitrogen, USA	15567027	1 M, pH 7.4
Tris-HCI缓冲液	Invitrogen, USA	15568025	1 M, pH 8.0
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560