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方法文章

使用生物素标记的RNA双链体测定靶蛋白的解旋酶活性

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源:Yu, L. 利用生物素标记在体外生化实验中研究蛋白质-核酸相互作用J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中,我们演示了检测目标蛋白解旋酶活性以解旋生物素标记的双链RNA底物的实验步骤。通过分析电泳迁移率变化,并结合使用化学发光酶偶联链霉亲和素进行化学发光检测,来鉴定该酶的活性。

方案

1. 蛋白质制备

  1. MOV10 表达载体
    1. 构建编码小鼠 MOV10 的 cDNA 表达载体。
      1. 为每个片段设置聚合酶链式反应(PCR)反应。混合 1 μ小鼠cDNA(来自C57BL/6小鼠睾丸),1 L μdNTP 溶液,2 L μ10 升 μM 正向引物,2 μ10 升 μM 反向引物,1 μL DNA聚合酶,25 μ2× PCR 缓冲液 L,以及 18 μ双蒸水 L2O (ddH₂O)2O)定容至 50 μL.
        注意: 用于扩增的引物 Mov10 基因片段列于 表1.
      2. 使用以下程序进行PCR反应:95 °C 5分钟,35个循环:95℃加热 °C,退火 64℃ 15 秒 °C,15 秒;72 ℃延伸 °C,20 秒(扩增长片段 MOV10 时为 2 分钟),最后在 68 °7 分钟,4 ℃
    2. 通过凝胶电泳分析扩增的PCR DNA,在紫外灯下迅速切下凝胶中所需大小的条带,并将其放入离心管中。 
      注意: 在琼脂糖凝胶上可见的 MOV10 预期产物大小为 3015 bp。
    3. 使用凝胶回收试剂盒,按照生产商说明书纯化PCR产物DNA。
      1. 加入等体积的溶解缓冲液至步骤1.1.2中的离心管,并在50–55 °在 50 °C 水浴中孵育 5–10 分钟,确保凝胶完全融化。短暂离心,收集管壁上的液滴。   
        注意: 凝胶和溶解缓冲液的质量/体积浓度为 1 mg/μL.
      2. 将吸附柱放入收集管中,将含有溶解凝胶片段的溶液转移至吸附柱中,于12,000 × g离心 x g 2 分钟。
      3. 弃去收集管底部的滤液。加入 600 μ将 L 洗涤缓冲液加入柱中,于 12,000 离心 x g 1 分钟,弃去滤液。
      4. 重复步骤 1.1.3.3 一次。
      5. 将柱子放回收集管中,于12,000 × g离心 x g 2分钟,以彻底去除残留的洗涤缓冲液。
      6. 将吸附柱置于一个1.5 mL无菌离心管中,加入50 μddH₂O 的升2O至吸附柱中心,于12,000离心 x g 孵育1分钟。使用分光光度计测定洗脱液的DNA浓度。
    4. 质粒的限制性消化
      1. 用BamHI和XhoI酶切pRK5载体,通过混合4 μpRK5 载体 5 克 μ10倍消化缓冲液,1 L μL 的 BamHI,以及 1 μXhoI 和 ddH 的 L2O 至终反应体积为 50 μL. 37℃孵育 °2小时,C
    5. 通过凝胶电泳分析载体DNA,在紫外灯下用手术刀迅速切下凝胶中目标大小的条带,并将其放入离心管中。
    6. 使用凝胶回收试剂盒按照制造商说明书纯化载体DNA,步骤见1.1.3。         
    7. 将0.03 pmol线性化载体、0.06 pmol cDNA片段和2混合,建立标准的重组连接反应 μL 连接酶和 4 μ5x 连接酶缓冲液 L 和 ddH₂O2O,最终反应体积为10 μL.
      注意: 将MOV10克隆至pRK5载体中。
    8. 在37℃下孵育混合物 °C 反应 30 分钟,然后立即在冰上冷却 5 分钟。将 MOV10 重组质粒转化至 DH5α 细菌
      注意: 通过Sanger测序验证所有重组构建体。
    9. 通过向液体培养物中加入等体积的50%甘油,制备含有经验证重组质粒的细菌甘油冻存液,并于-80℃保存 °C.         
      注意: 在每次后续实验中,从甘油菌种中划线接种细菌至新鲜的琼脂平板,然后按照步骤1.2所述,挑取单菌落进行扩增。
  2. 从HEK293T细胞中提取的MOV10蛋白
    1. 在培养的 HEK293T 细胞中瞬时表达 MOV10 蛋白。
      1. 制备浓度为的 MOV10-pRK5 质粒 >500 ng/μL.
      2. 在15 cm培养皿中接种HEK293T细胞。当细胞密度达到约70%–90%时,将细胞培养基更换为含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素的新鲜杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)。
      3. 一次转染时,将60 μg 的 MOV10-pRK5 质粒 DNA 溶于 3 mL 低血清培养基中,然后加入 120 μL 转染增强试剂,充分混匀。
      4. 在另一支试管中稀释90 μ将转染试剂与3 mL无青霉素-链霉素的低血清培养基混合,充分混匀。
      5. 将稀释后的DNA加入每管稀释的转染试剂中,室温孵育15分钟。
      6. 将转染混合物加入细胞培养物中,培养细胞约36–48小时。
    2. 36–48 小时后,从每块培养板中收集细胞至 50 mL 离心管中。在 500 × g 条件下离心 x g 4℃下5分钟 °C. 每个沉淀用10 mL预冷的PBS洗涤,500 × g离心收集细胞 x g 4℃下5分钟 °C.
    3. 将沉淀重悬于 3 mL 含有完全不含乙二胺四乙酸(EDTA)的蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液中。冰上孵育 30 分钟。将裂解液在 20,000 × g 离心 x g 和 4 °20 分钟,C
    4. 加入100 μ每皿细胞使用1.5 mL离心管中适量的抗FLAG磁珠。
    5. 用K150缓冲液(50 mM HEPES,pH 7.5,150 mM KoAc,1 mM DTT,0.1% NP-40)将磁珠洗涤2次。
      1. 将磁珠重悬于1 mL预冷的K150缓冲液中。
      2. 将磁珠在 4℃ 孵育 2 分钟 °在轻轻旋转的条件下于 C 中孵育,并使用磁铁沉淀磁珠。移除并弃去上清液。
    6. 将磁珠加入步骤1.3.3的细胞裂解液上清中,4℃孵育 °2小时,4℃
    7. 用K150缓冲液将蛋白结合的磁珠洗涤3次,然后用含250 mM NaCl的K150缓冲液洗涤2次,再用K150缓冲液洗涤3次,步骤同1.3.5。
    8. 将珠子重悬于 300 μL FLAG 洗脱缓冲液(100 mM NaCl,20 mM Tris-HCl pH 7.5,5 mM MgCl₂)2,10% 甘油),加入 FLAG 肽至终浓度为 0.5 μ克/μL,并在旋转仪上与珠子一起于4℃孵育 °在 4°C 下孵育 1 小时,然后使用磁铁收集磁珠。
    9. 收集含有洗脱的MOV10蛋白的上清液,测定浓度后于-80℃保存 °用于将来使用。

2. 核酸制备

  1. 从合适的供应商处购买带或不带生物素标记的DNA和RNA寡核苷酸(oligos)。将每种寡核苷酸用无RNase的ddH2O稀释至20 μM,并于-80 °C保存以备后续使用。
    注意:本研究中使用的DNA/RNA底物的寡核苷酸序列列于 表2中。
  2. 为进行MOV10解旋酶活性测定中的双链RNA(dsRNA)退火反应,配制如下混合液:在终体积为20 μL的反应体系中,加入pH 7.5的60 mM N-2-羟乙基哌嗪-N-乙烷磺酸(HEPES)、6 mM KCl、0.2 mM MgCl2以及无RNase的ddH2O。
  3. 通过将生物素标记的上链(终浓度2 μM)与1.5倍量未标记的互补下链在退火缓冲液(步骤2.2)中混合,于95 °C加热5分钟,然后缓慢冷却至室温(RT),使RNA寡核苷酸退火形成RNA双链结构。

3. 体外生化实验

  1. 电泳迁移率变动分析(EMSA)和酶促反应
    1. 进行MOV10解旋酶活性检测时,在终体积为20 μL的反应体系中混合以下组分:pH 7.5的50 mM Tris-HCl、20 mM KoAc、2 mM MgCl2、0.01% NP-40、1 mM DTT、2 U/μL RNase抑制剂、10 nM生物素标记的RNA底物、2 mM三磷酸腺苷(ATP)、100 nM RNA捕获序列(RNA trap)和20 ng MOV10蛋白,并用ddH2O补足体积。将反应混合物在37 °C下分别孵育10分钟、30分钟和60分钟,随后加入5×终止缓冲液以终止反应。
      注意:RNA捕获序列是一种未标记生物素的寡核苷酸,其序列与标记的寡核苷酸互补,可防止解链后的双链RNA重新退火。
  2. 聚丙烯酰胺凝胶制备
    1. 清洗玻璃板(16 cm × 16 cm)和1.5 mm厚的梳子,并组装电泳装置。
    2. 配制10%非变性聚丙烯酰胺凝胶:混合14 mL ddH2O、1.25 mL 10×TBE缓冲液(Tris-硼酸-EDTA)、8.3 mL 30%丙烯酰胺溶液、1.25 mL 50%甘油、187.5 μL 10%新配制的过硫酸铵(APS)以及12.5 μL四甲基乙二胺(TEMED)。
    3. 配制20%非变性聚丙烯酰胺凝胶:混合5.5 mL ddH2O、1.25 mL 10×TBE缓冲液、1.25 mL 50%甘油、16.7 mL 30%丙烯酰胺溶液、187.5 μL 10% APS以及12.5 μL TEMED。
    4. 立即倒入玻璃板之间,并插入梳子,室温下静置约30分钟使其充分聚合。
  3. 凝胶电泳
    1. 取出梳子,并向电泳槽中加入电泳运行缓冲液(0.5×TBE)。
    2. 用0.5×TBE缓冲液冲洗加样孔,然后将凝胶置于冰浴中以100 V预电泳30分钟,之后更换为新鲜的0.5×TBE运行缓冲液。
    3. 每孔上样20–25 μL样品。
    4. EMSA实验使用10%非变性丙烯酰胺凝胶,酶促反应实验使用20%非变性丙烯酰胺凝胶。在冰浴条件下以100 V进行电泳,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部四分之一处。 
  4. 拆卸玻璃板,切除加样孔及未使用的泳道部分,将凝胶转移至0.5×TBE缓冲液中。
  5. 将滤纸和尼龙膜裁剪至与凝胶相同大小,并用缓冲液预先润湿干净的滤纸和尼龙膜。
  6. 组装转膜夹心结构
    1. 将预先润湿的尼龙膜放置在预先润湿的滤纸上。
    2. 将凝胶置于尼龙膜上。
    3. 在凝胶上方覆盖另一层预先润湿的滤纸。
    4. 用洁净的移液枪头从中心向边缘滚动,以去除所有气泡。
  7. 在半干式电转仪中以90 mA电流将样品从凝胶转移至尼龙膜,持续20分钟。
  8. 停止转膜后,将膜置于新的滤纸上干燥1分钟。
  9. 使用配备254 nm紫外灯的紫外交联仪,在120 mJ/cm2 条件下照射45–60秒进行交联(使用自动交联功能),随后在室温下空气中干燥30分钟。
  10. 化学发光检测
    1. 方案1:使用商品化化学发光核酸检测试剂盒的标准体积操作。
      1. 向膜中加入20 mL封闭缓冲液,在摇床上以20–25 rpm轻柔振荡孵育15–30分钟。
      2. 在20 mL封闭缓冲液中加入66.7 μL稳定化的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物,配制偶联物/封闭缓冲液工作液。
      3. 轻轻弃去封闭缓冲液,替换为偶联物/封闭缓冲液,继续在摇床上以20–25 rpm振荡孵育15分钟。
      4. 用缓冲液洗涤膜4次,每次在40–45 rpm下振荡5分钟。
      5. 向膜中加入30 mL底物平衡缓冲液,在20–25 rpm下振荡孵育5分钟。
      6. 将6 mL鲁米诺/增强剂溶液加入6 mL稳定过氧化物溶液中,配制成底物工作液。避光操作。 
      7. 用底物工作液完全覆盖膜表面,孵育5分钟。
      8. 在化学发光成像系统中扫描1–3秒以获取信号。

表1:用于PCR扩增基因的引物 Meiob 和 Mov10 的片段 正向和反向引物中的粗体字母为BamHI和NotI酶切位点;反向引物中斜体粗体字母为XhoI酶切位点;加框的粗体字母表示对应R235A点突变的核苷酸。

片段引物序列(从 5’ 到 3’)
MEIOB-A正向CGGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
反转ATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C正向CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
反转CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E正向CCGCGTGGATCCATGTTACTTTCTTTGATACACTTGCC
反转CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut正向CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
反转GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10正向GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
反转GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

表2:本研究中使用的DNA/RNA底物序列。

名称序列(5' 至 3')
图 2、536 nt 单链 DNA5'-Biotin-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (DNA)
图 336 nt 单链 RNA5'-Biotin-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3' (RNA)
图 454 nt 5'-末端带尾的双链 RNA5'-Biotin-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA)
5'-ACGAGGGAGACGAGGAGACGGAGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA)

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
离心机Eppendorf, Germany5242R
化学发光成像系统Tanon, China5200
数字式超声波破碎仪Branson, USABBV12081048A450 瓦特;50/60 赫兹
半干式电泳转膜仪Hoefer, USATE77XP
管式旋转混合器 Crystal, USA3406051
紫外光交联仪UVP, USACL-1000
材料
尼龙膜Thermo Scientific, USATG263940A
TC处理培养皿Corning, USA430167100 毫米 
TC处理培养皿Corning, USA430597150 毫米 
微量离心管AXYGEN, USAMCT-150-C1.5 毫升 
离心管Corning, USA43079115 毫升
试剂 
抗FLAG M2磁珠Sigma, USAM8823
ATPThermo Scientific, USA591136
BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒Beyotime, ChinaC3206
CelLyticTM M细胞裂解试剂 Sigma, USA107M4071V
ClonExpress II一步克隆试剂盒 Vazyme, ChinaC112
化学发光核酸检测试剂盒Thermo Scientific, USAT1269950
dNTPSigma-Aldrich, USADNTP100-1KT
DMEMGibco, USA10569044
EDTAInvitrogen, USAAM9260G0.5 M
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Roche, USA4693132001
EndoFree大提质粒试剂盒Vazyme, ChinaDC202
FastPure凝胶DNA小提试剂盒Vazyme, ChinaDC301-01
FBSGibco, USA10437028
FLAG多肽Sigma, USAF4799
甘油Sigma, USASHBK3676
HEPES缓冲液Sigma, USASLBZ28371 M 
KOAcSangon Biotech, China127-08-02
MgCl2Invitrogen, USAAM9530G1 M
NaClInvitrogen, USAAM97595M
NP-40Amresco, USAM158-500ML
Opti-MEM培养基Gibco, USA31985062
PBSGibco, USA10010023pH 7.4
RNase抑制剂Promega, USAN251B
链霉亲和素-碱性磷酸酶Promega, USAV5591
TBEInvitrogen, USA15581044
Tris-HCI缓冲液 Invitrogen, USA155670271 M, pH 7.4
Tris-HCI缓冲液 Invitrogen, USA155680251 M, pH 8.0
Tween-20Sangon Biotech, ChinaA600560

标签

RNA ATP RNA