基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

摘要

来源：de la Peña Avalos, B.，等，通过免疫荧光法观察DNA修复蛋白的相互作用。J. Vis. Exp. (2020)。

在本视频中，我们介绍了免疫荧光方法，用于观察经辐射处理的细胞核中DNA双链断裂位点处DNA修复蛋白γH2AX和53BP1的定位情况。

方案

1. 细胞核提取与细胞固定

1. 配制储备液：0.2 M PIPES（pH 6.8）、5 M NaCl、2 M 蔗糖、1 M MgCl₂、0.1 M EGTA（pH 8.0）。
2. 配制核提取缓冲液（NEB）：将10 mM PIPES（pH 6.8）、100 mM NaCl、300 mM 蔗糖、3 mM MgCl₂、1 mM EGTA（pH 8.0）和0.5%（v/v）Triton X-100 溶于ddH₂O中，搅拌至完全溶解。
3. 配制4%（v/v）多聚甲醛（PFA）：将10 mL 16% PFA水溶液加入30 mL PBS中。搅拌至完全溶解。
4. 在适当时间点（t=0、1、2、4、16 h），用1 mL PBS洗涤细胞两次，彻底去除PBS。
5. 每孔加入200 μL NEB以提取细胞核（细胞质被降解，仅保留细胞核）（图1）。室温孵育2分钟，然后彻底去除缓冲液。
   注意：孵育时间不得超过2分钟。
6. 用1 mL PBS洗涤细胞，彻底去除PBS。添加PBS时需小心，此步骤中细胞非常脆弱。
7. 每孔加入200 μL 4%（v/v）PFA进行细胞固定。4 °C孵育10分钟，然后彻底去除PFA。
8. 每孔加入1 mL PBS。
   注意：细胞可在4 °C的PBS中保存。

2. 免疫荧光染色

1. 配制封闭液：将5% BSA（w/v）溶于PBS中，并加入0.3%（v/v）Triton X-100，混匀至完全溶解。
2. 配制稀释缓冲液：将1% BSA（w/v）溶于PBS中，并加入0.3%（v/v）Triton X-100，混匀至完全溶解。
3. 进行封闭时，每孔加入200 μL封闭液。室温孵育2小时，或4 °C孵育16–18小时。
   注意：若使用山羊来源的抗体，需在封闭液中添加5%山羊血清。
4. 用稀释缓冲液稀释一抗（1:500；抗体列表见表1），涡旋振荡至充分混匀。
   注意：若使用山羊来源的抗体，需在稀释缓冲液中添加1%山羊血清。
5. 在湿盒或孵育盒内放置一片Parafilm膜，滴加10 μL一抗溶液（单滴）。将盖玻片的一边对准液滴边缘，缓慢放下盖玻片，使液体均匀铺展（尽量避免产生气泡）。室温孵育2小时。
6. 用PBS洗涤盖玻片三次，每次1分钟。
7. 用稀释缓冲液稀释二抗（终浓度：2 μg/mL），涡旋振荡至充分混匀。
8. 参照一抗操作方法，加入10 μL二抗溶液。室温孵育2小时。
   注意：避光操作。

表1：所用抗体。本研究中所用抗体的列表。

抗体	公司	货号	来源
53BP1	Cell Signaling	4937	兔
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150103	驴
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139), clone JBW301	Millipore	05-636	小鼠
Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150081	山羊

9. 用 PBS 清洗盖玻片 3 次，每次 1 分钟。
10. 用 H₂O 清洗盖玻片 1 分钟。
11. 用 DAPI 对 DNA 进行复染：加入 10 μL 300 nM DAPI（抗体操作方法同上），室温孵育 30 分钟，然后用基于甘油的封片剂将样本封固于载玻片上。或者，在载玻片上加入一滴（10 μL）含 DAPI 的商用抗荧光淬灭封片剂，再盖上盖玻片。轻轻按压盖玻片，并用纸巾擦去周围多余的液体。
12. 用透明指甲油封固盖玻片，并静置干燥 20 分钟。
13. 将载玻片置于 4 °C 保存。

3. 图像采集

1. 在60倍物镜上滴加一滴浸油。使用DAPI通过目镜定位细胞核。
   1. 进行XYZ图像采集时，打开采集软件并选择参数：扫描类型：Galvano；扫描模式：往返扫描；图像大小：512×512；PMT模式：VBF；PMT平均：帧（4次）；PMT逐行扫描：线。
   2. 选择染料和探测器：
      通道（CH1），染料（DAPI），探测器（SD1）
      通道（CH2），染料（Alexa Fluor 488），探测器（HSD3）
      通道（CH3），染料（Alexa Fluor 647），探测器（HSD4）
   3. 在“Z”轴选项中选择开启。
2. 调节实时图像。点击实时窗口中的实时按钮。
   1. 调节焦距，并在“PMT”工具窗口中设置激光强度（%）、灵敏度（HV）、增益和偏移量。
      1. 调节激光强度（%）：用于控制亮度和光漂白。激光强度越高，信号越强，但样品会发生光漂白。
      2. 调节灵敏度（HV）：控制噪声水平。HV值越高，信号越强，但若过高则图像将出现噪声。
         注意：始终保持电压恒定。
      3. 调节偏移量：控制背景水平。
   2. 选择开始/结束（15层切片），用于Z轴层扫成像。
3. 开始图像采集。
   1. 选择保存图像的文件夹。点击LSM 开始按钮以开始采集图像。点击序列完成按钮以结束图像采集。

结果

图1. 核提取。

细胞在核提取前（左）和提取后（右）的代表性图像。提取后，细胞质应被消化，但细胞核结构应保持完整（右）。(A) 20倍放大；比例尺 = 20 μm；(B) 40倍放大；比例尺 = 10 μm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片 #1，18 mm 圆形（盖片）	Neuvitro	NC0308920	使用前需用 HCl 或乙醇清洗并灭菌。
不含钙、不含镁的 DPBS	Gibco	14190144	用于组织培养的 PBS
含 DAPI 的 SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	S36973	可使用 300 nM DAPI 与 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片介质替代。
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A3059	建议使用热激片段，以避免沉淀或背景干扰。
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	用于核提取缓冲液。
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	1255015	可使用 Polysine 载玻片替代。