基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

摘要

来源：de la Peña Avalos, B.，等，通过免疫荧光法观察DNA修复蛋白的相互作用。J. Vis. Exp. (2020)。

在本视频中，我们介绍了免疫荧光方法，用于观察经辐射处理的细胞核中DNA双链断裂位点处DNA修复蛋白γH2AX和53BP1的定位情况。

方案

1. 细胞核提取与细胞固定

1. 配制储备液：0.2 M PIPES（pH 6.8）、5 M NaCl、2 M 蔗糖、1 M MgCl₂、0.1 M EGTA（pH 8.0）。
2. 配制核提取缓冲液（NEB）：将10 mM PIPES（pH 6.8）、100 mM NaCl、300 mM 蔗糖、3 mM MgCl₂、1 mM EGTA（pH 8.0）和0.5%（v/v）Triton X-100 溶于ddH₂O中，搅拌至完全溶解。
3. 配制4%（v/v）多聚甲醛（PFA）：将10 mL 16% PFA水溶液加入30 mL PBS中。搅拌至完全溶解。
4. 在适当时间点（t=0、1、2、4、16 h），用1 mL PBS洗涤细胞两次，彻底去除PBS。
5. 每孔加入200 μL NEB以提取细胞核（细胞质被降解，仅保留细胞核）（图1）。室温孵育2分钟，然后彻底去除缓冲液。
   注意：孵育时间不得超过2分钟。
6. 用1 mL PBS洗涤细胞，彻底去除PBS。添加PBS时需小心，此步骤中细胞非常脆弱。
7. 每孔加入200 μL 4%（v/v）PFA进行细胞固定。4 °C孵育10分钟，然后彻底去除PFA。
8. 每孔加入1 mL PBS。

结果

图1. 核提取。

细胞在核提取前（左）和提取后（右）的代表性图像。提取后，细胞质应被消化，但细胞核结构应保持完整（右）。(A) 20倍放大；比例尺 = 20 μm；(B) 40倍放大；比例尺 = 10 μm。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片 #1，18 mm 圆形（盖片）	Neuvitro	NC0308920	使用前需用 HCl 或乙醇清洗并灭菌。
不含钙、不含镁的 DPBS	Gibco	14190144	用于组织培养的 PBS
含 DAPI 的 SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	S36973	可使用 300 nM DAPI 与 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片介质替代。
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A3059	建议使用热激片段，以避免沉淀或背景干扰。
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	用于核提取缓冲液。
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	1255015	可使用 Polysine 载玻片替代。