RNA-蛋白质下拉实验通过亲和提取分离RNA结合蛋白

摘要

来源：Kresoja-Rakic, J.，等。利用脱硫生物素-链霉亲和素亲和法纯化间皮瘤细胞中与RNA相互作用的蛋白质。 J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了一种 体外 RNA下拉实验用于鉴定与mRNA中腺苷酸-尿苷酸富集元件（ARE）序列相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）。将细胞裂解液中的目标RBPs与RNA探针混合，形成RNA-蛋白质复合物，随后分离这些复合物 通过 利用RNA探针上的去硫生物素标签与链霉亲和素标记的磁珠之间的亲和性进行亲和纯化。

方案

1. 胞质与核蛋白组分的制备

1. 在T150细胞培养瓶中接种4 × 10⁶个ACC-MESO-4细胞，使用添加10%胎牛血清（FBS）、1×青霉素/链霉素（100×）和2 mM L-谷氨酰胺（200 mM）的RPMI-1640培养基进行培养。当细胞融合度达到80–90%（约5–5.5 × 10⁶个细胞）时，开始提取细胞核和细胞质组分的蛋白质。
   注意：ACC-MESO-4细胞系来源于RIKEN生物资源中心。
2. 吸除培养基，加入15 mL 1× PBS洗涤细胞，轻轻倾斜培养瓶数次，随后吸除1× PBS。加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，将培养瓶置于37 °C孵育3分钟。
   注意：在显微镜下观察细胞是否脱落；若细胞仍贴壁，可将培养瓶轻拍手掌三次以促进脱落。
3. 加入7 mL含10% FBS、1×青霉素/链霉素（100×）和2 mM L-谷氨酰胺（200 mM）的RPMI-1640培养基，收集细胞至15 mL离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
4. 吸除上清液，用1.5 mL 1× PBS重悬细胞沉淀，转移至1.5 mL微量离心管中，在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。
   注意：从本步骤起，所有离心操作均需在4 °C进行，并将所有试剂置于冰上。
5. 用预冷的1.5 mL 1× PBS重悬细胞沉淀，在500 × g、4 °C条件下离心3分钟，弃去上清液。
   注意：细胞核提取试剂CER I、CER II和NER的所需用量分别为细胞沉淀压实体积的10、0.55和5倍；以下方案按细胞沉淀压实体积为20 µL计算。建议仅配制所需量的CER I试剂。
6. 加入200 µL预冷的细胞质提取试剂（CER I），并添加2 µL 1×蛋白酶抑制剂，例如，将1片蛋白酶抑制剂（无EDTA型）溶于500 µL水中，配制成100×储存液。该体积的CER I试剂足以裂解20 µL细胞沉淀压实体积。
   1. 为估算细胞沉淀压实体积，可将含有细胞沉淀的离心管与装有10、20、50或100 µL 1× PBS的1.5 mL离心管进行对比。
7. 剧烈涡旋振荡15秒以重悬细胞沉淀，冰上孵育10分钟。向管中加入11 µL预冷的细胞质提取试剂II（CER II），剧烈涡旋5秒，再于冰上孵育1分钟。
8. 剧烈涡旋5秒后，在16,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。将上清液转移至预冷的洁净离心管中。此上清液即为细胞质组分，用于后续RNA pull-down实验。
9. 用100 µL预冷的核提取试剂（NER）重悬剩余沉淀，并加入1 µL蛋白酶抑制剂（100×），剧烈涡旋15秒。建议仅配制所需量的含蛋白酶抑制剂的NER试剂。
10. 冰上孵育40分钟，期间每隔10分钟短暂涡旋15秒。
11. 在16,000 × g条件下离心10分钟，将上清液（即核蛋白组分）转移至洁净的预冷离心管中。
12. 立即采用双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度（参见材料表）。为控制各组分蛋白纯度，进行免疫印迹分析（图1），检测α-微管蛋白（仅在细胞质组分中阳性）和聚ADP-核糖聚合酶（PARP，仅在核组分中阳性）。
13. 为保持蛋白活性及其天然状态，将细胞质和核提取物分别分装为25 µL每份。将分装样品置于液氮中速冻5秒，直接储存于-80 °C。

2. 使用脱硫生物素标记RNA

1. 将RNA探针进行商业合成并经HPLC纯化。用无核酸酶水将其重悬至10 µM浓度。
   注意： 探针序列见表1。
2. 每个RNA下拉反应使用50 pmol的RNA。除用于标记RNA寡核苷酸3'末端的30% PEG外，所有试剂均需解冻后置于冰上保存。
3. 将5 µL的10 µM RNA探针（分别标记为CALB2 3' UTR (ARE)、CALB2 3' UTR (mtARE)和Unrelated-RNA (IRE)）转移至0.5 mL薄壁微量离心管中，在PCR仪中于85 °C孵育5分钟，随后立即置于冰上。
   注意： 此步骤至关重要，有助于RNA探针的结构松弛，提高其在标记过程中的可及性。
4. 对于单个30 µL反应体系，向含RNA的管中加入以下10 µL混合液：3 µL无核酸酶水、3 µL 10× RNA连接酶反应缓冲液、1 µL RNase抑制剂（40 U/µL）、1 µL脱硫生物素化胞苷二磷酸（1 mM）和2 µL T4 RNA连接酶（20 U/µL）。
   注意： 若要为3个样本额外准备（按3.2倍量）主混合液A，可混合9.6 µL无核酸酶水、9.6 µL 10× RNA连接酶反应缓冲液、3.2 µL RNase抑制剂（40 U/µL）、3.2 µL脱硫生物素化胞苷二磷酸（1 mM）和6.4 µL T4 RNA连接酶（20 U/µL）。
5. 小心加入15 µL 30% PEG至反应体系中。使用新的枪头轻轻混匀。在16 °C条件下过夜孵育。
6. 次日，准备以下试剂：新鲜且无核酸酶的5 M NaCl、氯仿:异戊醇（24:1比例）（例如，每反应96 µL氯仿和4 µL异戊醇）、预冷的100%乙醇以及预冷的70%乙醇。
7. 向RNA标记反应管中加入70 µL无核酸酶水，再加入100 µL氯仿:异戊醇，短暂涡旋混匀。在13,000 x g条件下离心3分钟。小心仅移取上层液体并转移至新的无核酸酶1.5 mL离心管中；避免接触下层有机相。
8. 加入10 µL 5 M NaCl、1 µL糖原和300 µL预冷的100%乙醇。将离心管置于-20 °C环境中2小时。
   注意： 此步骤完成后，实验可于次日继续进行。
9. 在13,000 x g、4 °C条件下离心15分钟。小心弃去上清液，勿扰动沉淀。加入300 µL预冷的70%乙醇，再次在13,000 x g、4 °C条件下离心5分钟。
10. 彻底弃去上清液，空气中干燥沉淀（15分钟）。用20 µL无核酸酶水重悬沉淀。
    注意： 应于当日进行RNA下拉实验。
11. 将RNA在90 °C孵育2分钟，随后立即置于冰上。在接下来的链霉亲和素磁珠预清洗步骤中，始终保持标记后的RNA处于冰上。
    注意： 孵育时间过长可能损伤RNA探针。

3. RNA-蛋白质下拉实验

1. 链霉亲和素磁珠的预清洗及与去硫生物素化RNA的孵育
   1. 每50 pmol RNA使用50 µL链霉亲和素磁珠。但应根据具体实验条件进行优化。
   2. 将链霉亲和素磁珠管涡旋振荡15秒，使用剪去尖端的移液枪头迅速转移200 µL（主混合液；足够进行3+1个反应）至洁净的1.5 mL防漏管中。将管子置于磁力架上，使磁珠吸附于管壁一侧，静置1分钟，吸除重悬液。
   3. 清洗磁珠时，将管子从磁力架上取下，加入400 µL 0.1 M NaOH和0.05 M NaCl溶液，轻轻吹打数次。再将管子放回磁力架，静置1分钟，吸除上清液。重复此步骤一次。
   4. 用200 µL 100 mM NaCl溶液清洗磁珠，吸除上清液。
   5. 将管子从磁力架上取下，加入200 µL 20 mM Tris（pH 7.5），通过吹打重悬磁珠，将管子放回磁力架，静置1分钟，吸除上清液。重复该步骤一次。
   6. 将管子从磁力架上取下，加入200 µL 1× RNA捕获缓冲液，短暂涡旋振荡以重悬链霉亲和素磁珠。使用剪去尖端的移液枪头取50 µL磁珠悬液，分别加入各标记的RNA管中。在滚轴混合仪上室温孵育30分钟。
2. 蛋白质与RNA的结合
   1. 将管子置于磁力架上，静置1分钟，吸除上清液。
   2. 向磁珠中加入50 µL 20 mM Tris（pH 7.5），通过吹打重悬磁珠。将管子置于磁力架上，静置1分钟，吸除上清液。重复此步骤一次。
   3. 向磁珠中加入100 µL 1× 蛋白质-RNA结合缓冲液，通过吹打重悬磁珠。
   4. 同时，配制以下混合液：10 µL 10× 蛋白质-RNA结合缓冲液、30 µL 50%甘油、50 µg胞质蛋白，并用无核酸酶水补足至100 µL。
      注意：为3个样本额外准备10%过量的主混合液B（共3.3份），配制如下：33 µL 10× 蛋白质-RNA结合缓冲液、99 µL 50%甘油、165 µg胞质蛋白，并用无核酸酶水补足至330 µL。将主混合液B管置于冰上保存。
   5. 将管子置于磁力架上，静置1分钟，收集上清液（即流穿液，FT）。加入100 µL主混合液B，轻轻吹打混匀，避免产生气泡。在4 °C下于滚轴混合仪上孵育60分钟。
3. 清洗与洗脱
   1. 将管子置于磁力架上，收集上清液（即流穿液，FT），转移至新管中。
      注意：将此流穿液（FT）置于冰上保存，用于后续分析。
   2. 向磁珠中加入100 µL 1× 清洗缓冲液，轻轻吹打混匀，放回磁力架，静置1分钟，弃去上清液。重复此步骤两次。
   3. 向磁珠中加入40 µL洗脱缓冲液，通过吹打混匀，在37 °C下于振荡器（950 rpm）中孵育30分钟。
   4. 将管子置于磁力架上，静置1分钟，收集洗脱液（即洗脱组分，E）。立即置于冰上，用于后续分析。
      注意：在此步骤中，每个测试的RNA探针均包含流穿液（FT）和洗脱液（E）两个组分。

结果

图 1：5 µg 胞质和核蛋白组分的蛋白质印迹分析。 PARP 蛋白存在于核组分（N）中，但在胞质组分（C）中缺失；α-微管蛋白存在于胞质组分（C）中，但在核组分（N）中缺失。

表1：RNA探针序列

RNA探针

序列

浓度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NE-PER 核与胞质提取试剂盒	赛默飞世尔科技	78833
Pierce 蛋白酶抑制剂片剂，无 EDTA	赛默飞世尔科技	A32965
Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23225
Pierce 磁性 RNA-蛋白下拉试剂盒	赛默飞世尔科技	20164	包含磁珠，因此试剂盒需在 4 ℃ 保存 °C
Pierce RNA 3’ 末端脱硫生物素化试剂盒	赛默飞世尔科技	20163	该试剂盒是 "Pierce 磁性 RNA-蛋白质下拉试剂盒"，并需在 -20 ℃ 保存 °C 与下拉试剂盒不同（4 °C）。
DynaMag-2 磁力架	赛默飞世尔科技	12321D
RPMI - 1640 培养基	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - 过滤牛血清	Pan Biotech	P40-37500
青霉素-链霉素（100倍浓缩）	Sigma-Aldrich	P4333
L-谷氨酰胺溶液（200 mM）	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×）	Gibco（隶属于 Life Technologies）	25200-056
RNaseZap RNase 去污染溶液	赛默飞世尔科技	AM9780
RNA寡核苷酸合成	Mycrosynth AG，瑞士	-	合成规模 - 0.04 µmol - 高效液相色谱纯化
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030
6 M 盐酸（HCl）	PanReac AppliChem	182883.1211
超纯 1 M Tris，pH 7.5	赛默飞世尔科技	15567027
甘油	赛默飞世尔科技	17904	50% 无菌分装，于 -20 保存°C
Pierce 链霉亲和素磁珠	赛默飞世尔科技	88817	请注意，这些磁珠的平均直径为1 µ米（范围为0.5 - 1.5） µm）。此外，Dynabeads-M280 Streptavidin 是一种均一粒径为 2.8 µm，也用于RNA下拉实验，但需注意这可能影响纯化过程。
十四至十八水合硫酸铝	Sigma-Aldrich	368458
正磷酸	Applichem	A0637