基于SELEX的体外结合实验鉴定RNA-蛋白质相互作用

摘要

来源：Singh, R. 探索序列空间以鉴定调控性RNA结合蛋白的结合位点。J. Vis. Exp. ( (2019)。

在本视频中，我们介绍了通过指数富集配体系统进化（SELEX）方法，筛选针对目标蛋白的特异性RNA结合序列。该方法将目标蛋白与大量随机序列的RNA文库共同孵育，分离出与蛋白结合的RNA序列，再通过PCR扩增和测序，以确定其与蛋白结合的位点。

方案

1. 蛋白质结合反应及结合RNA的分离

1. 在100 µL体积的10 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中进行蛋白质与RNA的结合反应，加入以下成分至终浓度：50 mM KCl、1 mM DTT、0.09 µg/µL牛血清白蛋白、0.5 units/µL RNasin、0.15 µg/µL tRNA、1 mM EDTA，以及30 µL适当浓度的重组蛋白（PTB）。从相应的RNA文库中加入RNA。
   注意：剪接因子U2AF65通常以约1–10 nM的结合亲和力（平衡解离常数或K_d）结合模型内含子的多嘧啶 tract/3'剪接位点。因此，前两轮结合实验中使用的蛋白浓度为U2AF65的K_d值的10倍；而对于SXL和PTB蛋白，该范围内的起始浓度仅为我们的最佳估计。这确保了目标RNA物种能够结合，尽管低亲和力序列也可能被结合。在第3轮和第4轮（转录、结合和扩增）中，蛋白浓度降低至原来的三分之一，以有效去除低亲和力的RNA物种。
2. 将含有结合反应的离心管置于25 °C的温控金属块中（或置于冰上）约30分钟。
3. 在前四轮筛选-扩增过程中，使用以下步骤将结合的RNA与未结合的RNA分离。
   1. 在室温下将样品（100 µL）通过连接真空泵的硝酸纤维素滤膜进行过滤。
      注意：<....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
凝胶电泳设备	标准	标准
硝酸纤维素膜	Millipore	HAWP
硝酸纤维素膜	Schleicher & Schuell	PROTRAN
聚丙烯酰胺凝胶溶液	标准	标准
蛋白酶K	NEB	P8107S
重组PTB蛋白	实验室制备	不适用
逆转录酶	NEB	M0277S
真空抽滤装置	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm 玻璃微分析真空滤器
真空抽滤装置	Millipore	XX2702552	1225 取样真空抽滤装置
X射线胶片	标准	标准
玻璃板	标准	标准