基于SELEX的体外结合实验鉴定RNA-蛋白质相互作用

摘要

来源：Singh, R. 探索序列空间以鉴定调控性RNA结合蛋白的结合位点。J. Vis. Exp. ( (2019)。

在本视频中，我们介绍了通过指数富集配体系统进化（SELEX）方法，筛选针对目标蛋白的特异性RNA结合序列。该方法将目标蛋白与大量随机序列的RNA文库共同孵育，分离出与蛋白结合的RNA序列，再通过PCR扩增和测序，以确定其与蛋白结合的位点。

方案

1. 蛋白质结合反应及结合RNA的分离

1. 在100 µL体积的10 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中进行蛋白质与RNA的结合反应，加入以下成分至终浓度：50 mM KCl、1 mM DTT、0.09 µg/µL牛血清白蛋白、0.5 units/µL RNasin、0.15 µg/µL tRNA、1 mM EDTA，以及30 µL适当浓度的重组蛋白（PTB）。从相应的RNA文库中加入RNA。
   注意：剪接因子U2AF65通常以约1–10 nM的结合亲和力（平衡解离常数或K_d）结合模型内含子的多嘧啶 tract/3'剪接位点。因此，前两轮结合实验中使用的蛋白浓度为U2AF65的K_d值的10倍；而对于SXL和PTB蛋白，该范围内的起始浓度仅为我们的最佳估计。这确保了目标RNA物种能够结合，尽管低亲和力序列也可能被结合。在第3轮和第4轮（转录、结合和扩增）中，蛋白浓度降低至原来的三分之一，以有效去除低亲和力的RNA物种。
2. 将含有结合反应的离心管置于25 °C的温控金属块中（或置于冰上）约30分钟。
3. 在前四轮筛选-扩增过程中，使用以下步骤将结合的RNA与未结合的RNA分离。
   1. 在室温下将样品（100 µL）通过连接真空泵的硝酸纤维素滤膜进行过滤。
      注意：RNA-蛋白质复合物会留在滤膜上，而未结合的RNA则不会。
   2. 用无菌剃刀将保留有RNA的滤膜切成小片段，并转移至离心管中。将滤膜碎片浸入蛋白酶K（PK）缓冲液中，轻轻翻转混匀至少3小时（或过夜），以回收RNA。
   3. 在等体积的酚-氯仿（1:1）中涡旋振荡RNA样品以去除蛋白质，随后再用氯仿处理一次。每次处理后，在室温下高速离心5分钟，收集水相。
   4. 向水相中加入乙酸钠（0.1体积的3.0 M，pH 5.2）和乙醇（2–3体积的无水乙醇，200 proof）。将离心管置于-80 °C冰箱中30分钟，高速离心10分钟，经洗涤和干燥后，将RNA溶解于经DEPC处理的水中。
4. 在最后两轮（第5轮和第6轮；转录、结合和扩增）中，按以下方法将蛋白结合的RNA组分与未结合组分分离。进一步将结合反应（步骤1.1）中的蛋白浓度降低至原来的三分之一，以增强筛选压力，富集高亲和力结合序列，并优先去除低亲和力序列。
   1. 在设置上述RNA:蛋白结合反应（步骤1.1）之前，预先配制含0.5x TBE缓冲液（Tris-硼酸-EDTA）的非变性聚丙烯酰胺凝胶（5%，丙烯酰胺:双丙烯酰胺比例为60:1）。在低温室（4 °C）中对该凝胶施加250 V电压电泳15分钟。
   2. 将上述RNA:蛋白结合反应液（步骤1.1）分别加入该凝胶的不同加样孔中。
      注意：蛋白储存于-80 °C，使用前用含20 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）（pH 8.0）、20%甘油、0.2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.05% NP-40和1 mM二硫苏糖醇（DTT）的缓冲液稀释。可选择性添加0.5–1.0 mM蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）。在结合反应中，该缓冲液贡献约6%的甘油，因此样品可直接上样至加样孔，无需额外加入上样缓冲液。
   3. 在低温室（4 °C）中以250 V电压进行凝胶电泳1至2小时，分离结合与未结合的RNA。此过程也称为凝胶迁移率变动分析（gel mobility shift assay）。
      注意：电泳时间根据所用RNA和蛋白的特性而有所不同。
   4. 将凝胶暴露于X光胶片，通过放射自显影确定结合RNA的位置，切下含有结合RNA的凝胶条带并转移至离心管中。
   5. 将切碎的凝胶条带在用于洗脱的PK缓冲液中孵育3小时或过夜。
   6. 将洗脱出的RNA样品先用酚-氯仿剧烈涡旋振荡，再用氯仿处理一次。
   7. 氯仿抽提后，向水相中加入乙酸钠和乙醇。在-80 °C冰箱中孵育后，于4 °C离心5–10分钟以收集RNA沉淀。用乙醇洗涤RNA沉淀，并打开管盖晾干。将RNA溶解于经DEPC处理的水中。
      注意：改用凝胶迁移率变动分析进行分离，可消除在初始筛选轮次中可能因非特异性结合（例如结合至硝酸纤维素滤膜或其他基质）而被富集的非目标RNA物种。

2. 逆转录与PCR扩增

1. 使用逆转录酶和反向引物，将溶解的RNA在20 µL反应体系（包含2 µL 10x RT缓冲液、2 µL AMV逆转录酶、1 µM反向引物、10 µL RNA，可选添加RNase抑制剂）中于42 °C孵育60分钟，合成cDNA。
2. 使用20–25个PCR循环扩增cDNA。通过聚合酶链式反应（PCR）将T7 RNA聚合酶启动子连接至文库，反应体系包含1 µM DNA随机文库模板、每种引物各1 µM、20 mM Tris（pH 8.0）、1.5 mM MgCl₂、50 mM KCl、0.1 µg/µL乙酰化牛血清白蛋白、2单位Taq聚合酶，以及每种dNTP（脱氧鸟苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷三磷酸）各200 µM。

3. 转录与蛋白质结合

1. 重复进行RNA合成、蛋白质结合以及结合蛋白与未结合蛋白组分的分离过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
凝胶电泳设备	标准	标准
硝酸纤维素膜	Millipore	HAWP
硝酸纤维素膜	Schleicher & Schuell	PROTRAN
聚丙烯酰胺凝胶溶液	标准	标准
蛋白酶K	NEB	P8107S
重组PTB蛋白	实验室制备	不适用
逆转录酶	NEB	M0277S
真空抽滤装置	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm 玻璃微分析真空滤器
真空抽滤装置	Millipore	XX2702552	1225 取样真空抽滤装置
X射线胶片	标准	标准
玻璃板	标准	标准