利用微量热泳技术研究溶液中蛋白质-脂质相互作用

摘要

来源：Sparks, R. P. 等 使用微尺度热泳技术测量蛋白质-脂质相互作用 视频实验杂志 (2022)

本视频演示了利用微尺度热泳技术研究蛋白质-脂质相互作用的方法。该检测通过定量荧光标记蛋白质在温度梯度下的热泳运动来检测分子间的相互作用。将荧光标记分子与不同浓度的非荧光脂质分子混合后，将溶液中的分子混合物装入毛细管中。对毛细管中的样品施加温度梯度，检测并记录荧光分子在温度梯度中的迁移行为。

方案

1. 材料准备

1. 制备磷酸盐缓冲液（PBS）：137 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM NaH₂PO₄ 和 2 mM KH₂PO₄， pH 7.4。
2. 制备 NTA-Atto 647 N 染料。将 NTA-Atto 647 N 染料的母液从 100% DMSO 溶液中用不含 Tween 的 PBS 稀释至 100 nM。
3. 在 E. coli 中表达 Vam7-His8 蛋白——作为融合蛋白表达，并使用 Ni-NTA 和凝胶过滤层析进行纯化。
4. 在 PBS 缓冲液中滴定分析物。如果分析物处于不同的缓冲液中，除非分析物缓冲液中的成分与标记蛋白发生相互作用，否则标记的微量热泳（MST）对诸如 DMSO 等小分子引起的微小缓冲液差异并不特别敏感。

2. MST 设备的准备

1. 打开设备背面的电源开关。
2. 打开控制软件，确保笔记本电脑已开机，并且与连接到设备的计算机处于连接状态。
3. 输入本实验的荧光和微尺度热泳（MST）参数设置。设定 MST 前 到 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cy5 马来酰亚胺单反应性染料	GE Healthcare	PA23031	用于蛋白质标记
GraphPad Prism	GraphPad Software
Monolith NT.115 毛细管（1000 支装）	Nanotemper	MO-K022	MST 实验用毛细管
Monolith NT.115 仪器	Nanotemper		大学设备
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	用于 His 标签的标记物
磷脂酰肌醇-3-磷酸二辛酰酯（PI(3)P diC8）	Echelon	P-3008	结合实验用脂质