利用微量热泳技术研究溶液中蛋白质-脂质相互作用

摘要

来源：Sparks, R. P. 等 使用微尺度热泳技术测量蛋白质-脂质相互作用 视频实验杂志 (2022)

本视频演示了利用微尺度热泳技术研究蛋白质-脂质相互作用的方法。该检测通过定量荧光标记蛋白质在温度梯度下的热泳运动来检测分子间的相互作用。将荧光标记分子与不同浓度的非荧光脂质分子混合后，将溶液中的分子混合物装入毛细管中。对毛细管中的样品施加温度梯度，检测并记录荧光分子在温度梯度中的迁移行为。

方案

1. 材料准备

1. 制备磷酸盐缓冲液（PBS）：137 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM NaH₂PO₄ 和 2 mM KH₂PO₄， pH 7.4。
2. 制备 NTA-Atto 647 N 染料。将 NTA-Atto 647 N 染料的母液从 100% DMSO 溶液中用不含 Tween 的 PBS 稀释至 100 nM。
3. 在 E. coli 中表达 Vam7-His8 蛋白——作为融合蛋白表达，并使用 Ni-NTA 和凝胶过滤层析进行纯化。
4. 在 PBS 缓冲液中滴定分析物。如果分析物处于不同的缓冲液中，除非分析物缓冲液中的成分与标记蛋白发生相互作用，否则标记的微量热泳（MST）对诸如 DMSO 等小分子引起的微小缓冲液差异并不特别敏感。

2. MST 设备的准备

1. 打开设备背面的电源开关。
2. 打开控制软件，确保笔记本电脑已开机，并且与连接到设备的计算机处于连接状态。
3. 输入本实验的荧光和微尺度热泳（MST）参数设置。设定 MST 前 到 3 s, MST 到 30 s，以及 荧光恢复（Fluo.） 之后 1 s. 之前 测量初始荧光，无需长时间；MST 是热诱导后达到平衡所需的实际时间。
4. 毛细血管表：对于每根毛细管，输入靶标（配体）的名称、配体（分析物）的名称、靶标的浓度以及最高滴定浓度，并使用自动填充滴定比例。例如，输入 50 nM 作为 Vam7-His8 的靶标浓度 Vam7-His8 靶分子名称为（1,2-二辛酰基磷脂酸）Di-C8 PA，配体名称为1:1，并将配体最高浓度向下拖动以自动填充第2至第16号孔位。
5. 运行一个 帽扫描 选择合适的LED（20% LED（预设）） 根据目标蛋白的信号 并将标记的MST调整至200至2000荧光单位之间。 帽扫描 应呈现均匀、圆润的钟形峰。
6. 选择一系列MST功率，并为每个功率输入测试值，以确定最稳定的结合拟合与命中结果 开始帽扫描 + 测量，扫描不同数值以确定被测相互作用的最佳操作条件。
7. 使用分析软件和Tjump预设的热泳条件，确定具有最佳拟合度的MST功率。根据最低浓度与最高浓度之间荧光分离最显著的情况，结合最佳拟合MST功率分析拟合结果，并选择用于重复实验的MST功率。
8. 通过进入分析软件并将分析模式切换为专家模式，判断第一次和第二次运行之间是否发生了光漂白。接着，选择荧光而非热泳进行分析。选择专家模式，然后选择光漂白。

3. 标记MST样品的制备

1. 将 Vam7-His8 溶液用不含 Tween 的 PBS 缓冲液稀释至浓度为 200 nM。
2. 将 NTA-Atto 647 染料用不含 Tween 的 PBS 缓冲液稀释至浓度为 100 nM。
3. 按 1:1 的体积比混合 Vam7-His8 与 NTA-Atto 647 染料，避光室温孵育 30 分钟。 参照第 2.5 节确定目标蛋白的合适浓度（参见 视频中展示的 Ni-NTA 染料 KD 值应用补充说明）。
4. 在避光条件下，使用台式离心机以约 8,161 × g 的离心力将 NTA-Atto 647 N 染料与蛋白的混合物离心 10 分钟。
5. 实验后将混合物置于 4 °C 保存，或在实验期间置于冰上，以便在数小时内重复使用，防止蛋白变性。
6. 使用 NT 浓度测定工具确定滴定所需的浓度范围。
7. 将 Di-C8 PA 用纯水稀释至适当的最大浓度。
8. 根据上一步结果，在 PBS 缓冲液中对分析物进行 1:1 系列稀释，共配制 16 个浓度。与表面等离子共振（SPR）不同，热泳技术对缓冲液差异的敏感性较低。

4. 样品的微量热泳动实验

1. 打开设备及连接的笔记本电脑。
2. 按下仪器前面的上箭头按钮，滑出毛细管架。
3. 将毛细管装入支架中，最高浓度置于第 1 位。
4. 在控制软件中，选择对应 NTA-Atto 647 N 的红色通道。
5. 在 毛细管表格中输入每根毛细管的浓度、位置和名称信息。
6. 点击 开始毛细管扫描 执行毛细管扫描，LED 强度设为 20%（预设值），并根据需要调整 LED 强度或配体（标记蛋白）浓度，使荧光信号保持在 200 至 2000 荧光单位之间。
7. 选择合适的 MST 功率范围。
8. 启动 毛细管扫描 + MST 测量。
9. 使用分析软件进行数据分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cy5 马来酰亚胺单反应性染料	GE Healthcare	PA23031	用于蛋白质标记
GraphPad Prism	GraphPad Software
Monolith NT.115 毛细管（1000 支装）	Nanotemper	MO-K022	MST 实验用毛细管
Monolith NT.115 仪器	Nanotemper		大学设备
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	用于 His 标签的标记物
磷脂酰肌醇-3-磷酸二辛酰酯（PI(3)P diC8）	Echelon	P-3008	结合实验用脂质