定量流式细胞术研究标记的蛋白质-磷脂囊泡相互作用

摘要

来源:Podoplelova， N. et al.， 使用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微泡的相互作用。J. Vis. Exp. （2022 年）

在本视频中，我们使用定量流式细胞术演示了蛋白质和人工磷脂囊泡之间的相互作用。荧光标记的蛋白质与荧光标记的磷脂囊泡的结合增加了平均荧光强度，这种增加通过流式细胞仪检测。

方案

1. 通过流式细胞术检测蛋白质-脂质相互作用

1. 动力学结合实验
   1. 在 Tyrode 缓冲液（20 mM HEPES、150 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、0.4 mM NaH₂PO₄、2.5 mM CaCl₂、5 mM 葡萄糖、0.5% BSA，pH 7.4）中稀释磷脂囊泡至浓度为 1 μM，总体积为 250 μL。
   2. 将步骤 1 中浓度为 500 nM 的荧光标记凝血因子 X （fX-fd） 与步骤 1.1.1 中的磷脂囊泡以 1:1 的比例混合（最终囊泡浓度为 0.5 μM，fX-fd 浓度为 250 nM 的 fX）至总体积为 500 μL。
   3. 立即将 500 μL 混合悬浮液（低流速分析为 ~20 分钟）注入流式细胞仪。使用低流速并确保通道 FL2 的阈值（激发 488 nm，发射滤光片 585/42 nm）为值 200。测量材料表中荧光染料的通道 FL4（激发 633 nm，发射滤光片 660/20）中的平均荧光><。 注意: 选择不带自动进样器的细胞仪。这将加快将样品注入测量池的过程。
   4. 当达到结合饱和度时（5 分钟内荧光没有显着增加），用 Tyrode 缓冲液快速稀释样品 20 倍，并监测解离，直到达到基线荧光（完全解离）或直到达到平台期（5 分钟内荧光没有显着降低><）。 注意:作为对照，加入 10 μM EDTA 并监测完全解离 5 分钟。

材料