定量流式细胞术研究标记蛋白与磷脂囊泡相互作用

摘要

来源：Podoplelova, N. 等，利用定量流式细胞术分析荧光标记蛋白与人工磷脂微囊泡的相互作用。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们利用定量流式细胞术演示蛋白质与人工磷脂囊泡之间的相互作用。荧光标记的蛋白质与荧光标记的磷脂囊泡结合后，会使平均荧光强度增加，该变化可通过流式细胞仪检测。

方案

1. 通过流式细胞术检测蛋白质-脂质相互作用

1. 动力学结合实验
   1. 将磷脂囊泡用 Tyrode 缓冲液（20 mM HEPES、150 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl₂、0.4 mM NaH₂PO₄、2.5 mM CaCl₂、5 mM 葡萄糖、0.5% BSA，pH 7.4）稀释至浓度为 1 µM，总体积为 250 µL。
   2. 将步骤 1 中制备的荧光标记凝血因子 X（fX-fd）以 500 nM 的浓度与步骤 1.1.1 中的磷脂囊泡按 1:1 体积比混合（最终囊泡浓度为 0.5 µM，fX-fd 中 fX 的浓度为 250 nM），总体积为 500 µL。
   3. 立即将 500 µL 混合悬液（以低流速分析，约持续 20 分钟）注入流式细胞仪。使用低流速，并将 FL2 通道（激发波长 488 nm，发射滤光片 585/42 nm）的阈值设为 200。测量 FL4 通道（激发波长 633 nm，发射滤光片 660/20）中来自材料表所列荧光染料的平均荧光强度。
      注意：选择无自动进样器的流式细胞仪，可加快样品注入测量池的过程。
   4. 当结合达到饱和（5 分钟内荧光强度无显著增加）时，迅速用 Tyrode 缓冲液将样品稀释 20 倍，并监测解离过程，直至荧光恢复至基线水平（完全解离）或达到平台期（5 分钟内荧光强度无显著下降）。
      注意：作为对照，加入 10 µM EDTA，并监测完全解离过程持续 5 分钟。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）	Thermo Fisher Scientific	A37573	荧光染料
BD FACSCantoII	BD Bioscience
DiIC16(3)（1,1'-二十六烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐）	Thermo Fisher Scientific	D384	荧光染料
DMSO	Sigma Aldrich	D8418
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
L-α-磷脂酰丝氨酸（脑源，猪源）（钠盐）	Avanti Polar Lipids	840032P
L-α-磷脂酰胆碱（脑源，猪源）	Avanti Polar Lipids	840053P
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610020-1EA
氯化钾	Sigma Aldrich	P9541-500G
无水氯化钙，粉末，≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	S3139-250G
氯化钠	Sigma Aldrich	S3014-500G
氯化镁	Sigma Aldrich	M8266-100G
牛血清白蛋白	VWR Life Science AMRESCO	Am-O332-0.1
乙二胺四乙酸二钠盐	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1