耗散型微重力测量技术研究蛋白质-脂质双层相互作用

摘要

来源：Matos, A. L. L.，等。利用石英谐振器通过耗散型微天平技术研究磷脂结合蛋白Annexin A2与固相支撑脂双层的结合动力学。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频演示了一种耗散性微重力测定技术，用于研究蛋白质与脂双层的结合。将小单层囊泡加入到石英传感器表面，使其包被微天平的传感器表面。利用目标磷脂结合蛋白与脂双层之间依赖钙离子的结合特性，监测传感器振荡频率的变化以及振荡能量的耗散，以确定蛋白质与脂双层结合的性质。

方案

注意：缓冲液应使用 0.22-µm 滤膜过滤，并在真空条件下脱气 1 小时。

1. 脂质囊泡的制备

1. 使用 2 mL 玻璃试管。将每种脂质，即 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（POPS）和胆固醇（Chol），分别溶解于氯仿/甲醇（50:50 v/v）混合溶剂中，制备成澄清的 5 mM 脂质溶液。将 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇-4',5'-二磷酸)（PI(4,5)P₂）溶解于氯仿/甲醇/水（20:9:1 v/v）混合溶剂中。
2. 按照所需的摩尔比，将上述溶解的脂质在 10 mL 玻璃试管中混合：POPC/POPS（80/20）、POPC/PI(4,5)P2（95/5）、POPC/POPS/Chol（60/20/20）、POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol（60/17/3/20）以及 POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol（37/20/20/3/20）（表 1）。
   注意：总脂质的最终量为 500 µg。
3. 使用氮气流干燥以蒸发有机溶剂。将脂质混合物置于高真空（冻干）系统中 3 小时，以去除任何残留的溶剂痕迹。
   注意：此步骤将形成一层干燥透明的脂质膜。
4. 将脂质膜重悬于 1 mL 枸橼酸盐缓冲液（10 mM 三钠枸橼酸盐，150 mM NaCl，pH 4.6）中。将脂质悬液在 60 °C 水浴中孵育 30 分钟（该温度比混合物中最高相变温度脂质的相变温度高约 10 °C），每 5 分钟剧烈涡旋振荡一次。
   注意：此过程将形成大的多层囊泡（MLVs）。保持悬液温度高于相变温度。
5. 将配备有孔径为 50 nm 聚碳酸酯膜的挤出器预热（本实验中为 60 °C），并在高于相变温度（此处为 40–50 °C）的条件下预热 30 分钟。
6. 将 MLV 悬液装入预热的挤出器中，并缓慢地使混合物穿过聚碳酸酯膜 31 次，以形成小单层囊泡（SUVs）。保持温度高于相变温度。
7. 将 SUV 悬液转移至 2 mL 塑料反应管中，并加入枸橼酸盐缓冲液（见步骤 1.4），使最终体积达到 2 mL。
   注意：最终脂质浓度为 250 µg/mL。

2. 石英传感器的处理

注意：务必使用镊子操作石英传感器。

1. 将四个插入聚四氟乙烯支架中的传感器在2% SDS溶液中孵育≥30分钟。用超纯水彻底清洗以完全去除SDS，并用干燥的氩气或氮气流吹干。
2. 使用等离子清洗系统彻底去除任何污染物。将干燥的传感器插入等离子清洗腔室，抽真空后用氧气冲洗3次。开启等离子清洗仪，采用以下工艺参数：压力1×10^-4 Torr，高射频（RF）功率，处理时间10分钟。关闭仪器并取出传感器。

3. 微量天平操作

注意：采用一种包含四个温控流室的微天平系统，流室为并联配置，连接至蠕动泵，并设定流速为 80 µL/min。在开放流动模式下，缓冲液从供液储液器泵入接收槽。在循环模式下，将接收槽与供液储液器连接，形成闭合回路。温度设定为 20 °C。

1. 使用镊子小心地将经等离子清洗的传感器插入4个流体腔室中。避免对腔室及管路施加任何压力或扭转，以防发生泄漏。
2. 以开放流动模式用柠檬酸盐缓冲液（10 mM 三钠柠檬酸盐，150 mM NaCl，pH 4.6）冲洗系统10分钟。
   注意： 这需要恰好 3.2 mL 缓冲液，但建议使用过量缓冲液（10 mL）。
3. 启动程序，开始记录基频第一谐波的频率和耗散变化n = 1次谐波）以及高次谐波（n = 3至13次）进行监测，直至频率和耗散基线稳定（此过程大约需要40至60分钟）。
   注意： 频率噪声水平（峰峰值）应低于 0.5 Hz，耗散值应低于 0.1·10⁻⁶⁶，其在水溶液中的最大漂移为频率1 Hz/小时和0.3·10-⁶/小时的耗散速率
4. 当基线稳定后，加入柠檬酸盐缓冲液中的SUV悬浮液（2 mL置于小管中）。使用反应容器，移除1.5 mL的死体积，然后将系统闭合为循环流动模式。继续记录频率/耗散变化10分钟。
   注意： 在此期间，囊泡将铺展到 SiO₂ 表面并融合形成连续的双层膜（第2步） 图1, 图2，以及 图3）。SUVs在传感器表面的吸附呈双相性，并在耗散信号中表现出典型的频率最小值和最大值。形成一个稳定的新频率/耗散基线，其特征频率偏移（取决于脂质组成）为26–29 Hz（见 表1）表示表面存在连续的双层结构。
5. 当SLB稳定后（见步骤3.4），用运行缓冲液（10 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4）在所需的Ca²⁺条件下平衡系统。²⁺ 浓度（范围从 50 µM 到 1 mM CaCl）₂，根据实验需要）以开放流模式运行40分钟。
6. 将蛋白（此处为 AnxA2）加入含有 Ca 的电泳缓冲液中²⁺ （参见步骤3.5）。以循环流动模式加样蛋白，直至达到平衡稳态（步骤3） 图1, 图2，以及 图3).
   注意： 蛋白浓度范围可为 1 至 400 nM。蛋白吸附会导致频率发生依赖于浓度的偏移，反映吸附质量（蛋白）的变化。
7. 通过在开放流模式下使用含 5 mM EGTA 的运行缓冲液螯合 Ca²⁺ 离子来解离结合的蛋白（步骤 4） 图1 和 图2).
   注意： 频率和耗散恢复至SLB基线水平表明蛋白质结合完全可逆。可通过重复结合-解离循环来比较不同浓度或不同蛋白质。

结果

表1：SLB的脂质组成及形成数据

...

组分	SLB形成后的ΔΔF/Hz	SLB形成后的ΔΔD×10-6
POPC/POPS(80 : 20)	26.3 ± 0.2	0.26 ± 0.03
POPC/PI(4,5)P2(95 : 5)	26.5 ± 0.5	0.31 ± 0.02
POPC/POPS/Chol(60 : 20 : 20)	29.2 ± 0.2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
氯化钙	Merck	017-013-00-2	99%
氯仿	Roth	4432.1	99%
DOPC	Avanti	850375P
EGTA	PanReac AppliChem	A0878	99%
HEPES	PanReac AppliChem	A1069
甲醇	PanReac AppliChem	A3493
PiP2	Avanti	850155P
POPC	Avanti	850457P
POPS	Avanti	840034P
氯化钠	PanReac AppliChem	A1149
SDS	Roth	183
柠檬酸三钠	PanReac AppliChem	A3901
仪器设备
Extruder Liposofast	Avestin
Qsense E4 分析仪	Qsense
QSense Dfind	Qsense
泵 IPC 4	Ismatec	ISM 930
QSX 303 SiO2 二氧化硅 50nm	Qsense	QSX 303
PC 膜 0.05μm	Avanti polar lipids	610003
OriginPro	OriginLab Corporation		第 8 和 9 版