单分子成像可视化融合蛋白在DNA幕上凝聚体的组装

摘要

来源：Zuo, L. 等，DNA上EWS-FLI1凝聚体的单分子成像。J. Vis. Exp. (2021)

本视频介绍了一种利用单分子成像技术，在特定基因位点上可视化融合蛋白凝聚体在DNA分子上组装的方法。这些凝聚体的形成源于LCD-LCD和LCD-DBD相互作用，从而能够招募RNA聚合酶II并增强基因转录。

方案

1. EWS-FLI1 在 DNA 幕布上凝聚体形成的成像

1. 打开成像软件，在明场下找到并标记 3 × 3 锯齿状图案的位置。
2. 以 0.2 mL/min 的流速启动流动，用双链 DNA 染料对 DNA 染色 10 分钟。
3. 在离心管中用成像缓冲液将 mCherry-EWS-FLI1 稀释至 100 nM 浓度，总体积为 100 µL。
4. 使用 100 µL 玻璃注射器通过阀门加载蛋白样品，并将流速调整为 0.4 mL/min。
5. 开启 488 nm 激光器，对每个区域进行预扫描以检查 DNA 分布状态；选择 DNA 分子分布均匀的区域。将 488 nm 激光器的激光功率设为 10%，561 nm 激光器设为 20%。使用功率计测量棱镜附近的实际激光功率：488 nm 激光器为 4.5 mW，561 nm 激光器为 16.0 mW。
6. 图像采集
   1. 同时开启 488 nm 和 561 nm 激光器，以 2 秒间隔开始采集图像。
   2. 将阀门从手动模式切换至注射模式，使成像缓冲液在 60 秒后将蛋白样品冲洗进入流动池。
      注意：此过程约需 30 秒，当 EWS-FLI1 蛋白进入流动池时，视野中将立即出现 mCherry 信号。
   3. 为去除游离的 EWS-FLI1，仅开启 561 nm 激光器，用成像缓冲液持续清洗流动池 5 分钟。停止流动，在 37 °C 下孵育 10 分钟。
   4. 以 0.4 mL/min 的流速启动流动，使 DNA 伸展，并在不同帧之间以 2 秒间隔采集图像，以获得 EWS-FLI1 凝聚体形成的高通量数据。

2. mCherry-EWS-FLI1 的强度分析

1. 将数据作为图像序列导入 ImageJ 软件，选取 25× GGAA 位点处 8×8 像素方框内的斑点，并以 .tif 格式保存图像。
2. 通过计算包含整个斑点的 8×8 像素方框内所有像素强度的总和来确定信号强度，并通过减去邻近相同大小区域背景的强度值来扣除背景信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
488 nm 半导体泵浦固体激光器	Coherent	OBIS488LS
561 nm 半导体泵浦固体激光器	Coherent	OBIS561LS
尼康倒置显微镜	Nikon	Eclipse Ti
PMMA	PMMA	Prime95B