本方案描述了一种对导入淋巴结切片中的荧光标记T细胞进行成像的方法。该技术可利用传统的宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜，对T细胞的迁移进行实时分析。
本文内容
摘要
摘要
初始T细胞持续迁移至次级淋巴器官（包括外周淋巴结），以识别罕见表达的抗原。T细胞进入淋巴结的过程较为复杂，涉及多种细胞和化学因子，其中包括趋化因子。近年来，双光子显微镜的应用使得研究人员能够在完整的淋巴结中追踪T细胞，并获取有关其行为及其与其他细胞相互作用的定量信息。尽管这种方法具有明显的优势 体内 系统，该方法需要复杂且昂贵的仪器，并且对组织的获取受限。为了分析T细胞在小鼠淋巴结内的行为，我们开发了一种组织切片实验方法 1最初由神经生物学家建立，近期被移植到小鼠胸腺研究中 2在此技术中，将荧光标记的T细胞接种于急性制备的淋巴结切片上。本视频文章利用宽场显微镜和共聚焦显微镜，实时分析T细胞在组织中的定位与迁移过程。该技术可作为补充方法 体内 双光子显微镜为在天然环境中成像T细胞以及阐明T细胞迁移机制提供了一种有效方法。
方案
1. 淋巴结切片的制备
- 制备用于包埋的4%低熔点琼脂糖溶液。将琼脂糖溶于PBS中，并用微波炉加热溶解。待琼脂糖完全溶解后，将溶液维持在37°C备用。
- 准备一个6孔组织培养板。每孔加入1.1 ml RPMI完全培养基，并在每个孔中插入一个组织型培养滤膜。将6孔板置于4°C冰箱中，直至准备转移组织切片。
- 将内径为4 mm的不锈钢垫圈放入盛有RPMI完全培养基的塑料培养皿中。这些垫圈后续将用于在振动切片过程中集中细胞。
- 根据当地动物福利法规处死小鼠。小心地从周围组织中分离外周淋巴结，并将其置于含有冰浴PBS的塑料培养皿中。操作时需注意避免损伤淋巴结结构，因为这些器官非常柔软。
- 将4%琼脂糖凝胶倒入35 mm塑料培养皿中，并轻柔地将淋巴结转移至凝胶中。将琼脂糖凝胶置于冰上5分钟，使其凝固。
- 从培养皿中取出凝胶块，并修整琼脂糖，使每个淋巴结周围保留3–5 mm的凝胶。
- 使用无毒组织胶将包埋好的淋巴结固定在振动切片机的样品盘上。将样品盘安装到盛有冰浴PBS的切片槽中。
- 使用振动切片机对包埋在琼脂糖中的组织进行切片，厚度设为320 μm，切片速度设为慢速范围（0.3 mm/s），振动频率设为中等范围（1.5 mm）。
- 使用精细镊子小心地将切下的淋巴结切片转移至组织型培养插件上。每张插件放置3个切片。操作时需格外小心，避免切片受损。典型的外周淋巴结在320 μm厚度下可获得约5个切片。弃去首尾两个切片，因其仅包含表层组织。
- 将不锈钢垫圈放置在每个单独的切片上。确保垫圈准确地位于组织周围琼脂糖之上。
- 将培养板置于37°C、5% CO2的湿化培养箱中孵育，直至准备接种T细胞。
2. 从小鼠淋巴结中分离T细胞
- 根据之前发表的 JoVE 文章3分离 T 细胞。
- 立即使用 T 细胞并进入下一节。否则，淋巴细胞可在添加了 10 ng/ml IL-7 的完全 RPMI 培养基中培养过夜。
3. 分离T细胞的标记
- 用HBSS洗涤细胞，并以相同缓冲液重悬，浓度为每毫升10 × 106 个细胞。
- 加入等体积含1 μM Cell Tracker green CMFDA的HBSS，使终浓度为0.5 μM。
- 将细胞悬液在37°C孵育5分钟，随后用完全RPMI培养基洗涤细胞两次。
- 将细胞重悬于完全RPMI培养基中，终浓度为每毫升10 × 106 个细胞。标记后的细胞将接种至组织切片上。
也可使用除CMFDA以外的其他荧光染料，但需注意这些分子在超过一定浓度时可能具有毒性。
4. 将标记的T细胞接种到淋巴结切片上
- 用移液器吸除清洗器内侧多余的培养基。注意不要让组织变干；此步骤需快速操作。
- 轻轻将10至20 μl标记的T细胞（相当于1至2 × 105个细胞）加入清洗器内侧。操作时务必避免移液器尖端接触组织。确保细胞悬液液滴保持原位。
- 将带有细胞的组织切片置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育至少30分钟，以使淋巴细胞迁移进入组织。
5. 淋巴结切片中T细胞的成像
在本视频文章中，我们使用宽场倒置显微镜和共聚焦直立显微镜对淋巴结切片中的荧光标记T细胞进行成像。
- 将温度设置为 37°C。我们的显微镜配备有温控培养室。
- 安装灌流系统，以实现用含氧（5% CO2, 95% O2）且不含酚红的 RPMI 培养基对淋巴结切片进行持续灌流。在我们的系统中，灌流培养基通过重力从一侧流入成像室，另一侧通过连接至废液收集瓶的泵进行吸出。将培养基流速设定为 1 ml/min。
- 使用精细镊子小心地将切片从 6 孔板中取出，并将其浸入预热的含氧 RPMI 培养基中数秒钟，以去除未浸润进入组织的荧光细胞。
使用宽场倒置显微镜对T细胞进行成像
- 将切片倒置放置于定制的成像腔室中，该腔室由粘附在玻璃底培养皿内侧的尼龙丝构成。在此腔室内，尼龙丝将切片抬离玻璃表面，使含氧溶液能够扩散至组织内部。由于淋巴结中T细胞的迁移高度依赖氧气，此步骤至关重要。通过在切片上放置不锈钢垫圈以固定切片。在此条件下，切片位于培养皿底部上方数微米处，有利于灌流液的更新。
- 为获得较大的视野（800 × 800 μm，约为淋巴结切片表面积的三分之一），使用10倍干式物镜采集图像。我们发现，10倍Nikon S fluor 0.5 NA物镜最适用于本研究的分析。
典型的延时成像实验在轴向（z轴）上捕获5个光学层面，总深度为50 μm。通常在10至20分钟内，以10至30秒的时间间隔对荧光标记的T细胞进行成像。
使用共聚焦直立显微镜对T细胞进行成像
本方案中使用的共聚焦显微镜为配备20倍水浸物镜（Olympus，20x/0.95 NA）的Leica SP5。
- 将切片固定在显微镜的成像台上。注意：我们通常在制备样本时放置一个垫圈以固定样本。
- 通过沿 z 轴采集一系列图像来设置成像过程。为了在完整的组织结构中成像 T 细胞，起始位置通常设置在首个标记的 T 细胞下方 5 至 10 μm 处。
6. 代表性结果
通过遵循本视频方案，您应能观察到大量荧光标记的T细胞聚集在淋巴结的T细胞区，这一现象通常在此特定环境中发生 在体 （图1）。特别是T细胞应被排除在B细胞区域之外，这些区域通常位于被膜下方。成功的实验还将导致T细胞被招募到组织中（图2），表现出高度活跃的运动行为（图3），与在完整淋巴结中获得的已发表结果一致 4单个T细胞在切片中的平均速度通常应接近 10 μm/min （图4）。
图1. T细胞在淋巴结切片中聚集。 在图像采集前30分钟，将荧光标记的T细胞（CMFDA，绿色）加入淋巴结切片（上方图像）。该图像为沿z轴方向跨越50 μm的5层图像的最大投影。下方显示明场图像。图像使用宽场显微镜采集。
图 2. T 细胞被招募至淋巴结切片中。 在使用共聚焦显微镜成像前 30 分钟，将荧光标记的 T 细胞（CMFDA，绿色）加入淋巴结切片中。图像分别在切面表面（上方图像）和表面下 40 μm 处（下方图像）采集。
图3. T细胞在淋巴结切片中具有高度运动性。 使用宽场显微镜对荧光标记的T细胞进行为期12分钟的成像。单个T细胞的运动轨迹以颜色编码的方式显示，从蓝色（运动性较低的细胞）到红色（运动性较高的细胞）表示位移的增加。轨迹由Imaris软件计算得出。白色线条沿淋巴结边缘走行，而虚线椭圆则界定出假定的B细胞区。
图4. 在淋巴结切片中，T细胞的移动速度接近10 μm/min。速度数据是使用Imaris软件根据图3所示的轨迹计算得出的。
讨论
我们描述了一种简单、快速且稳健的技术，用于制备淋巴结切片，以研究导入T细胞的行为。近年来，该方法已成功应用于胸腺和淋巴结切片，以鉴定调控T细胞定位与运动性的细胞外因子1,5。该技术还被用于测量胸腺细胞在阳性选择过程中以及T细胞在识别抗原时的Ca2+反应2,6。切片覆盖实验具有若干优势与局限性，值得深入讨论。值得注意的是，该系统允许对组织进行干预，若需通过药理学手段操控切片以干扰细胞迁移的分子调控过程，则此特性尤为有用。成像完成后，切片可进一步进行免疫组织化学处理，以获取有关已成像结构的更多信息。此外，可使用传统的宽场荧光显微镜进行观察。尽管其分辨率不及共聚焦或双光子显微镜，且单光子显微镜的光毒性理论上比双光子显微镜更严重，但它具有操作简便、成本较低以及激发波长选择范围更广的优势。
在完整淋巴结中对T细胞进行成像，需要静脉注射标记的淋巴细胞，使其随后归巢至淋巴器官。正如我们先前所展示的1，组织切片实验与过继转移实验完全兼容。然而，T细胞归巢至淋巴结所需的时间较长，可能会导致易于随时间从细胞中泄漏的荧光染料使用受限。Fura-2这种Ca2+染料即属于此类情况。由于T细胞向组织的募集速度较快（< 30分钟），组织切片实验为使用此类染料提供了机会。最后，该方法具有显著优势，即可在多个保持活性的人体组织中分析T细胞功能。
该实验系统也存在一些需要牢记的局限性。切片过程中可能造成的损伤会影响T细胞的功能，尤其是在靠近切面的组织表层区域。为了评估切片内的细胞死亡情况，我们使用了荧光染料SYTOX Green，该染料能够穿透细胞膜受损的细胞。实验结果显示，约20%的淋巴结总细胞（主要位于组织的表层区域）被该核染料荧光标记。本实验方法的另一个潜在问题是切片是否能够保留重要的可溶性因子（包括趋化因子）。尽管目前没有证据表明我们的数据受到此类问题的影响（因为T细胞在切片中表现出良好的运动能力），但我们仍需强调，应在距离切面数十微米远的健康区域对T细胞进行成像观察。虽然本方案中使用了传统显微镜（如宽场或共聚焦显微镜）完成成像，但结合双光子成像技术的淋巴结切片制备方法有望提高深层组织的空间分辨率，并降低光毒性。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Alain Trautmann 博士，他鼓励我们进行淋巴结切片实验。本工作部分得到了法国抗癌联盟、法国医学研究基金会以及癌症研究协会资助项目的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | SP5 | |
| 振动切片机 | Leica Microsystems | VT1200S | |
| 精细镊子 | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| 30 mm 培养插件 | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | 完全RPMI培养基的配制方法为添加10%热灭活胎牛血清和青霉素/链霉素 |
| Hanks’ 平衡盐溶液 (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| 低凝胶温度琼脂糖，VII-A型 | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| 氰基丙烯酸丁酯胶，Vetbond | 3M | 1469 | |
| 不锈钢垫圈，内径4 mm | 任意供应商 | ||
| 细胞追踪绿色荧光染料 CMFDA | Invitrogen | C7025 |
参考文献
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. , (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
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