在支撑脂双层上进行pH调控检测以分析蛋白质-磷脂酰肌醇相互作用

摘要

来源：Shengjuler, D.，等，芯片上的 PIP：蛋白质-磷脂酰肌醇相互作用的无标记研究。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们利用微流控平台上的pH值调节检测法，演示了蛋白质与磷脂酰肌醇脂质之间的相互作用。该方法采用对pH敏感的荧光染料标记支撑脂双层中的磷脂酰乙醇胺脂质。当蛋白质与磷脂结合后引起pH值变化，从而导致荧光淬灭。

方案

1. 形成支撑脂质双层（SLB）

1. 将 100 µL 含 PI(4,5)P2 的 SUV 转移至 0.65 mL 微量离心管中。加入 6.4 µL 0.2 N 盐酸，调节溶液 pH 至约 3.2。
   注意：使用配备微型 pH 探头的 pH 计确认溶液 pH（参见材料表）。
2. 通过进样口用移液器将 10 µL pH 调节后的 SUV 溶液加入每个通道，并通过移液器施加压力，直至溶液到达出样口。将移液器吸头从移液器上取下，但仍保持连接在装置上。
3. 对每个通道重复上述步骤，然后在室温下孵育装置 10 分钟。
   注意：在装置组装完成后应立即进行囊泡向微通道内的注入。
4. 分别切割进样管和出样管，长度分别为 60 cm（进样管）和 8 cm（出样管）。
   注意：将管路斜向切割以形成锐利边缘，有助于将管路插入进样口和出样口。出样管应呈弧形。进样管的长度可根据显微镜装置进行调整。管路的内径为 0.05 cm。
5. 使用镊子将出样管组连接至装置，然后用胶带将装置固定在显微镜载物台上。
6. 将进样管组的一端浸入装有 25 mL 流动缓冲液的锥形管中，并用胶带固定，确保管路稳固。
7. 将锥形管置于高于装置约 20 cm 的位置，以利用重力流推动溶液通过微通道；可使用实验室升降台实现此高度差。
8. 对于每根进样管，使用注射器从管路的自由端吸取 1 mL 流动缓冲液。将移液器吸头从进样口取下，并将进样管的自由端插入装置中。
   注意：在进样口处加入一滴流动缓冲液，以降低此步骤中气泡进入通道的可能性。进样管连接至装置后，使用无尘擦拭布去除多余的缓冲液。
9. 重复上述步骤，将所有进样管连接至装置。
   注意：让流动缓冲液流经通道有助于去除多余的囊泡，并使双层膜达到实验条件下的平衡状态。
10. 打开显微镜控制软件（参见材料表）。在左侧面板中，点击“显微镜”选项卡，并选择“10X”物镜。
11. 点击工具栏中的“实时”和“Alexa 568”图像图标。使用细调和粗调旋钮，对微通道进行聚焦。
12. 扫描整个装置，检查 SLB 和通道的质量（图 1）。然后点击工具栏中的“荧光快门关闭”图像图标。
13. 点击“采集”选项卡，在“基本调整”下选择“曝光时间”，并将曝光时间设置为“200 ms”。
14. 在左侧面板中点击“多维采集”，在滤光片菜单下选择红色通道（标记为“Alexa 568”）。然后点击“时间推移”菜单，将时间间隔设为 5 分钟，持续时间设为 30 分钟，点击“开始”。
    注意：根据持续时间（30 分钟）和流速（约 1.0 µL/min），每个通道内 SLB 平衡需消耗 30 µL 流动缓冲液，即 8 个通道共需 240 µL 流动缓冲液。
15. 在“测量”选项卡下选择“圆形”工具，并在任意通道中绘制一个圆圈。选中该圆圈后右键点击，选择“属性”。在“轮廓”选项卡下勾选“所有 T”，以查看荧光强度随时间的变化。
    1. 确保该曲线达到平台期，表明已达到平衡状态，然后进入下一步。
16. 将缓冲液液面降至与装置齐平，以停止流动。
17. 保存时间推移文件。

2. 测试PLC-δ1 PH结构域与含PI(4,5)P2的固体支持双层膜（SLB）的相互作用

1. 使用流动缓冲液作为稀释剂，配制PH结构域的不同浓度稀释液。
   注意：由于芯片内有八个通道，至少使用其中两个作为空白对照。选择两侧最外端的通道，并将剩余通道用于蛋白质稀释液。测试的PH结构域浓度分别为：0.10、0.25、0.50、1.00 和 2.50 µM。每种稀释液约需 200 µL，可在 30 分钟内达到平衡。
2. 依次取下每个出口管路，使用移液器将 200 µL 各种蛋白质稀释液加入出口通道中。不要施加任何压力，让重力自然驱动液体流入。移液器吸头取下后应保持连接在微流控装置上。
3. 对每个通道重复上述步骤，并确保在此过程中未将气泡引入通道内。
4. 将进口管路降低至微流控装置下方的低位，以启动蛋白质在微通道中的流动。将管路的自由端用胶带固定至废液容器中。让蛋白质稀释液持续流动 30 分钟。
   注意：此操作将使流动方向反转，从而使蛋白质进入通道。达到平衡所需的时间以及所需的蛋白质稀释液体积取决于相互作用的亲和力。
5. 在软件左侧面板的“时间序列”选项卡下，点击“开始”以重新启动成像。
6. 实验完成后，保存时间序列文件。

结果

图1：SLB和微通道完整性的评估。(A) 显示高质量SLB和微通道的图像。(B) 融合不完全。(C) 已融合的微通道。(D) 微通道内截留的灰尘颗粒。(E) 微通道内截留的气泡。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
L-α-磷脂酰肌醇-4-磷酸	Avanti Polar Lipids	840045X	PI4P
L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸	Avanti Polar Lipids	840046X	PI(4,5)P2
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺	Avanti Polar Lipids	850757C	POPE；用于合成oSRB-POPE
丽丝胺罗丹明B磺酰氯（混合异构体）	ThermoFisher Scientific	L-20	用于合成oSRB-POPE
pH敏感型荧光脂质探针（oSRB-POPE）	本实验室自制	N/A	本实验室合成（Huang D. 等，2013）
Axiovert 200M 倒置落射荧光显微镜	Carl Zeiss Microscopy	N/A	显微镜
AxioCam MRm 相机	Carl Zeiss Microscopy	N/A	相机
X-Cite 120	Excelitas Technologies	N/A	光源
Alexa 568 滤光片组	Carl Zeiss Microscopy	N/A	激发/发射波长：576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 软件	Carl Zeiss Microscopy	N/A	图像处理软件
吸头	VWR	10034-132	200 µL 移液器吸头；细长光滑吸头，用于将蛋白溶液加入微流控通道
吸头	VWR	53509-070	10 µL 移液器吸头；细长光滑吸头，用于将囊泡溶液加入微流控通道
Orion Star A321 pH计	Thermo Scientific	STARA3210	pH计
Orion 微型pH探头	Thermo Scientific	8220BNWP	微型pH探头
N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)	VWR	VWRB30487	HEPES，游离酸形式
氯化钠	VWR	BDH8014-2.5KGR	NaCl
管路	Allied Wire & Cable	TFT-200-24 N	内径：0.020–0.026 英寸（0.051–0.066 cm）；壁厚：0.010 英寸（0.025 cm）；柔性聚四氟乙烯薄壁管；天然本色
工业级氮气	Praxair	N/A	本地供应商
工业级氧气	Praxair	N/A	本地供应商
液氮	Praxair	N/A	本地供应商