定量细胞内氢核磁共振波谱法监测蛋白质-配体相互作用

摘要

来源：Barbieri, L. 等，利用高细胞密度生物反应器通过实时定量细胞内核磁共振监测人体细胞中的蛋白质-配体相互作用 J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了细胞内核磁共振波谱技术，用于研究未标记的过表达蛋白质与小分子之间的蛋白质-配体相互作用。通过在目标谱峰区域出现一组新的峰并逐渐取代原有峰的现象，可直观地确认配体与蛋白质的成功结合。

方案

1. 试剂与溶液的准备

1. 配制完全DMEM培养基：向440 mL DMEM中加入5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液和50 mL胎牛血清（FBS，终浓度为10% vol/vol）。
   注意：该溶液可在4 °C保存1个月。
2. 配制琼脂糖溶液：将150 mg低熔点琼脂糖溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，于85 °C加热溶解，得到1.5%（w/v）的溶液。使用0.22 µm滤膜过滤除菌。将琼脂糖溶液分装为每管1 mL，置于1.5 N
3. 配制生物反应器培养基。
   1. 将13.4 g DMEM粉末溶解于1 L超纯H₂O中。
      注意：根据具体应用，所需终体积可能不同（例如，配制500 mL培养基时，将6.7 g粉末溶解于500 mL H₂O中）。
   2. 加入2% FBS、10 mM NaHCO₃、1倍青霉素-链霉素（100倍储备液）和2% D₂O（例如，配制500 mL培养基时，加入10 mL FBS、0.4 g NaHCO₃、5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液和10 mL D₂O）。
   3. 使用pH计测量pH值，必要时用HCl调节至7.4。
      注意：通常初始pH值已非常接近7.4。
   4. 使用真空驱动的无菌滤器将生物反应器培养基过滤至无菌的250 mL或500 mL玻璃瓶中。
   5. 在超净工作台内，用带有两个软管接口的无菌金属头盖密封瓶口，并连接氟化乙烯丙烯共聚物（FEP）管路（外径 = 1/8"，内径 = 1.6 mm），该管路将连接至泵以及用于进气的0.22 µm聚四氟乙烯（PTFE）注射器滤器。

2. 生物反应器设置

1. 使用第二个流动单元核磁共振管组装流动单元，之后将替换为含有细胞的核磁共振管。请参考流动单元操作说明以正确组装。
   注意： 此时流动单元应已完成清洁（若未清洁，请执行步骤4.2）。
2. 将连接至流动单元温控系统的水浴设置为37 °C，并将储液瓶放入水浴中。
3. 将储液瓶的FEP管路连接至泵。
4. 将生物反应器阀门调至“旁路”位置，并用培养基预填充泵。
5. 将生物反应器阀门调至“流动”位置，并以0.1 mL/min的流速用培养基预填充生物反应器。

3. 细胞样品的制备

1. 从 CO₂ 培养箱中收集细胞。
   1. 从 CO₂ 培养箱中取出装有转染的 HEK293T 细胞的 T75 培养瓶，并移除用过的培养基。
   2. 用 7 mL（每次）室温（约 20 °C）的 PBS 洗涤细胞两次。
   3. 加入 2 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液使细胞脱落。添加溶液后，在室温下孵育 5 分钟以使细胞脱落。
      注意：转染后的细胞可能需要稍长时间才能脱落。如有必要，可在 37 °C 下孵育细胞。
   4. 加入 20 mL 完全 DMEM 培养基以灭活胰蛋白酶；通过反复吹打充分重悬细胞，并转移至 50 mL 离心管中。
   5. 在室温下以 800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   6. 用 10 mL 室温 PBS 洗涤细胞，以去除残留的培养基。
   7. 在室温下以 800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   8. 将细胞沉淀转移至 1.5 mL 带盖的微量离心管中。
2. 将细胞包埋于琼脂糖丝中。
   1. 将一份凝固的琼脂糖在 85 °C 水浴中融化，随后置于 37 °C 金属浴中保温，保持液态。
   2. 使用巴斯德吸管，向流动单元 NMR 管底部加入 60–70 µL 的 1.5% 琼脂糖凝胶，并将其置于冰上。这将形成一个约 5 mm 高的底部塞，以便将细胞样品置于 ¹H NMR 线圈的检测区域内。
   3. 将步骤 3.1.8 获得的细胞沉淀在 37 °C 金属浴中加热 15–20 秒。
   4. 将细胞重悬于 450 µL 琼脂糖溶液中。操作时需小心，避免产生气泡。
   5. 将细胞-琼脂糖悬液吸入一根长约 30 cm 的色谱用 PEEK 管（内径 = 0.75 mm），该管连接至 1 mL 注射器。
      注意：在吸入前，应先用室温 PBS 预填充 PEEK 管及注射器的死体积，以避免产生气泡。管子的长度并非关键因素。
   6. 让 PEEK 管在室温下冷却 2 分钟。
   7. 用 100 µL 室温 PBS 预填充流动单元 NMR 管。
   8. 缓慢推动注射器，将包埋在琼脂糖中的细胞丝注入流动单元 NMR 管中。
      注意：为使 NMR 管填充均匀，应先将 PEEK 管末端置于 NMR 管底部，然后缓慢左右摆动，逐步向上推进。
   9. 重复步骤 3.2.5、3.2.6 和 3.2.8，直至所有细胞-琼脂糖悬液均被注入。
3. 将细胞插入生物反应器。
   1. 从流动单元中取出空的 NMR 管，并将流速提高至 2 mL/min 数分钟，以清除进样管路中的残留气泡。
   2. 将流速调至 0.2 mL/min，然后缓慢而稳定地向上推入装有细胞的 NMR 管。
      注意：培养基的持续流动可防止插入过程中管内容物通过进样口发生倒流。

4. 生物反应器操作与清洗

1. 核磁共振实验期间的生物反应器操作。
   1. 将核磁共振波谱仪的温度设置为 310 K。
   2. 将流动单元插入波谱仪中。
   3. 在整个原位核磁共振实验过程中，以 0.1 mL/min 的流速向生物反应器供给培养基。
   4. 在实验的预定时间，使用无菌长针头注射器刺穿硅胶管，将目标外源分子的浓缩溶液注入培养基储液瓶中。
      注意： 培养基中该分子的最终浓度应根据已知的细胞毒性数据以及（如可获得）该分子跨细胞膜的预测/估算扩散速率来确定。
   5. 核磁共振实验结束后，将含有细胞的管路更换为空管，并用水冲洗流动单元。
2. 生物反应器原位清洗。
   1. 以 1 mL/min 的流速依次流过以下溶液清洗流动单元：0.2 M 氢氧化钠（NaOH）；3 M 柠檬酸；0.2 M NaOH，每种溶液至少清洗 30 分钟，最后用经无菌过滤的超纯水冲洗 >2 小时。
   2. 每次运行后，清洗并高压灭菌储液瓶及管路组件。

5. 核磁共振实验

1. 核磁共振实验的设置。
   注意：在制备细胞内核磁共振样品之前，应提前完成这些步骤，以避免细胞收集与数据采集之间出现任何延迟。
   1. 在核磁共振波谱仪上创建一个新的数据集，并设置所需核磁共振实验的参数。
   2. 设置一维 ¹H NMR实验的参数。
   3. 将 ¹H载波频率中心设在水信号的4.7 ppm处。
   4. 选择zgesgp脉冲程序，设置谱宽为20 ppm，并使用1000 µs的180°方波脉冲进行水信号抑制。设置扫描间延迟为1 s，采集32次扫描的谱图。
   5. 对于表达未标记CA II的细胞：选择p3919gp脉冲程序，设置谱宽为30 ppm以覆盖谱图的亚氨基区域，并调整二项式水信号抑制的延迟，使最大激发位于目标信号的化学位移处（在950 MHz下d7 = 20 µs）。设置扫描间延迟≥1 s，采集512次扫描。
   6. 对于表达 ¹⁵N标记SOD1的细胞：选择sfhmqf3gpph脉冲程序，将 ¹H和 ¹⁵N的谱宽分别设置为16 ppm和50 ppm，将 shaped pulse 的偏移和激发带宽分别设为8.5 ppm和6 ppm，并使用350 µs脉冲进行去耦方案（根据仪器选择garp4或其他）。设置扫描间延迟为0.3 s，采集16次扫描并在 ¹⁵N维上采集128个增量。
2. 实时核磁共振谱图采集。
   1. 将生物反应器插入核磁共振波谱仪后，等待数分钟以允许培养基交换完成。
      注意：当PBS被含2% D₂O的培养基取代时，可通过锁场信号的出现轻松监测该过程。
   2. 调节 ¹H通道的匹配与调谐，匀场，并计算 ¹H 90°硬脉冲的持续时间。
   3. 根据 ¹H硬脉冲调整每个脉冲序列中的 ¹H功率水平。
   4. 记录第一张zgesgp ¹H谱图，以检查样品内容和磁场均匀性。
   5. 将zgesgp以及p3919gp/sfhmqcf3gpph实验复制至所需数量，并将其加入采集队列中。 
      注意：zgesgp谱图仅用于监控样品状态和磁场均匀性，因此可跳过或以较低频率采集。
   6. 对于表达未标记CA II的细胞：对p3919gp谱图进行处理，应用零填充和指数线宽窗口函数（LB = 20 Hz）。
   7. 对于表达 ¹⁵N标记SOD1的细胞：对sfhmqcf3gpph谱图进行处理，在两个维度上均应用零填充和平方正弦钟形窗口函数（SSB = 2）。
      注意：可通过去除无信号区域进一步减小处理后谱图的大小（在Topspin中，通过设置所需的STSR和STSI值实现）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275
D2O	Sigma-Aldrich	453366
DMEM，高糖	Life Technologies	10313-021
DMEM，高糖，粉末	Sigma-Aldrich	D5648
FBS	Life Technologies	10270
HCl	Sigma-Aldrich	30721
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life Technologies	25030
低凝胶点琼脂糖，粉末	Sigma-Aldrich	A4018
NaHCO3，粉末	Carlo Erba	478537
PBS	Life Technologies	10010
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122
NaOH颗粒	Sigma-Aldrich	30620
胰蛋白酶-EDTA（0.05% (wt/vol)）	Life Technologies	25300-054
设备
配备5 mm CryoProbe的Avance III波谱仪	Bruker	n/a	所有配备5 mm探头的现代波谱仪和窄孔磁体均兼容。
InsightMR 流动单元	Bruker	n/a
来自ÄKTA FPLC 的 P-920 泵模块	GE Healthcare	n/a	任何FPLC、HPLC蠕动泵或注射泵均应与该流动单元兼容。