定量细胞内氢核磁共振波谱法监测蛋白质-配体相互作用

摘要

来源：Barbieri, L. 等，利用高细胞密度生物反应器通过实时定量细胞内核磁共振监测人体细胞中的蛋白质-配体相互作用 J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了细胞内核磁共振波谱技术，用于研究未标记的过表达蛋白质与小分子之间的蛋白质-配体相互作用。通过在目标谱峰区域出现一组新的峰并逐渐取代原有峰的现象，可直观地确认配体与蛋白质的成功结合。

方案

1. 试剂与溶液的准备

1. 配制完全DMEM培养基：向440 mL DMEM中加入5 mL 200 mM L-谷氨酰胺、5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液和50 mL胎牛血清（FBS，终浓度为10% vol/vol）。
   注意：该溶液可在4 °C保存1个月。
2. 配制琼脂糖溶液：将150 mg低熔点琼脂糖溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，于85 °C加热溶解，得到1.5%（w/v）的溶液。使用0.22 µm滤膜过滤除菌。将琼脂糖溶液分装为每管1 mL，置于1.5 N
3. 配制生物反应器培养基。
   1. 将13.4 g DMEM粉末溶解于1 L超纯H₂O中。
      注意：根据具体应用，所需终体积可能不同（例如，配制500 mL培养基时，将6.7 g粉末溶解于500 mL H₂O中）。
   2. 加入2% FBS、10 mM NaHCO₃、1倍青霉素-链霉素（100倍储备液）和2% D₂O（例如，配制500 mL培养基时，加入10 mL FBS、0.4 g NaHCO₃、5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液和10 mL D₂O）。
   3. 使用pH计测量pH值，必要时用HCl调节至7....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275
D2O	Sigma-Aldrich	453366
DMEM，高糖	Life Technologies	10313-021
DMEM，高糖，粉末	Sigma-Aldrich	D5648
FBS	Life Technologies	10270
HCl	Sigma-Aldrich	30721
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life Technologies	25030
低凝胶点琼脂糖，粉末	Sigma-Aldrich	A4018
NaHCO3，粉末	Carlo Erba	478537
PBS	Life Technologies	10010
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122
NaOH颗粒	Sigma-Aldrich	30620
胰蛋白酶-EDTA（0.05% (wt/vol)）	Life Technologies	25300-054
设备
配备5 mm CryoProbe的Avance III波谱仪	Bruker	n/a	所有配备5 mm探头的现代波谱仪和窄孔磁体均兼容。
InsightMR 流动单元	Bruker	n/a
来自ÄKTA FPLC 的 P-920 泵模块	GE Healthcare	n/a	任何FPLC、HPLC蠕动泵或注射泵均应与该流动单元兼容。