基于石英晶体微天平生物传感器的生物筛选技术研究蛋白质-药物相互作用

摘要

来源：Takakusagi, Y. 基于生物传感器的高通量生物筛选与生物信息学分析策略用于药物-蛋白质相互作用的全局验证。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种利用基于石英晶体微天平（QCM）生物传感器的T7噬菌体展示肽库生物筛选方法来研究蛋白质-药物相互作用的技术。通过在QCM生物传感器上对展示特异性肽段的噬菌体进行生物筛选，可特异性分离出高亲和力肽段，随后进行氨基酸测序，从而帮助确定靶标蛋白上的特异性相互作用位点。

方案

注意：以下是使用石英晶体微天平（QCM）生物传感器筛选识别药物的T7噬菌体，并通过感染大肠杆菌（E. coli，BLT5615）回收筛选出的噬菌体的步骤。有关形成自组装单分子层（SAM）的小分子衍生物的合成方法，以及构建T7噬菌体展示15肽随机肽库的方案，可参见其他文献。

1. QCM 传感器芯片的制备

1. 将陶瓷传感器芯片安装在27 MHz石英晶体微天平（QCM）装置的振荡器上，并在小分子固定化之前记录空气相中的本征频率（Hz）。
2. 取下芯片，使用移液器将20 μL小分子衍生物溶液（1 mM，70%乙醇）滴加到传感器芯片的金电极表面，该小分子可形成自组装单分子层（SAM）。
   注意： 传感器芯片上设有金电极（Au，0.1 mm厚，内径2.5 mm，面积4.9 mm²）的晶体部分极为纤薄，易碎（SiO₂，0.06 mm厚，内径9 mm），因此操作移液时务必小心。
3. 将芯片置于培养皿中，内部放置湿润的纸巾并避光，在室温（约20 °C）下静置1小时。
4. 用超纯水轻轻清洗电极表面，随后用注射器或气吹球吹入空气去除残留水滴。
5. 将传感器芯片重新安装至QCM装置，记录空气相中频率的降低值，以测定已固定的小分子量。
   注： 成功固定小分子至少需要100 Hz的本征频率降低（每1 Hz对应30 pg）。

2. 使用QCM生物传感器对T7噬菌体文库进行生物淘选（图1）

1. 将比色皿置于QCM生物传感器上，并放入专用磁力搅拌器，向比色皿中加入8 mL反应缓冲液（10 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，pH 7–8）。
2. 将QCM传感器芯片连接至振荡器，并放下振荡臂，使芯片浸入正在以1000 rpm速度搅拌的缓冲液中。
3. 在个人计算机（PC）上开始监测QCM频率，等待传感器图谱稳定，频率漂移降至约3 Hz/min。
4. 向比色皿中注入8 μL T7噬菌体文库（1—2 × 10¹⁰ pfu/mL）（终浓度：1—2 × 10⁷ pfu/mL），并在传感器上标记注射时间点。
5. 监测T7噬菌体与固定在金电极表面的小分子结合所引起的频率下降，持续10分钟。
6. 停止QCM频率监测，将传感器芯片从振荡器上取下，通过吹入空气和/或使用擦拭纸吸除的方式去除缓冲液。
7. 将传感器芯片放入湿润的培养皿中，并在金电极表面滴加20 μL处于对数生长期的大肠杆菌（E. coli，BLT5615）宿主细胞悬液（在37 °C振荡培养后加入IPTG至终浓度1 mM，OD₆₀₀ = 0.5—1.0）。
8. 盖上培养皿盖，并用铝箔包裹以避光。
9. 将培养皿置于37 °C、96孔微孔板混合仪上（1000–1500 rpm）孵育30分钟，以促进结合的T7噬菌体恢复。
10. 回收20 μL溶液，并将其悬浮于200 μL LB培养基中。
    注意：本步骤获得的样品可在4 °C保存一周。
11. 根据生产商说明书中的常规操作步骤，对噬菌体溶液进行系列稀释，用于噬菌斑分离和DNA测序。

结果

图1： 基于QCM生物传感器的T7噬菌体展示肽库生物筛选示意图 将展示随机肽的T7噬菌体文库注入含有缓冲液（持续搅拌）的比色皿中，其中QCM生物传感器芯片已浸入并使频率稳定。在监测到T7噬菌体与固定在传感器芯片金电极表面的小分子结合所导致的频率降低后，将传感器芯片从振荡器上取下。随后，在宿主存在的情况下，直接回收与芯片结合的T7噬菌体中的DNA E. coli (BLT5615) 感染。分离获得的 T7 噬菌体 通过 根据通用的噬菌体展示方法，确定在T7噬菌体衣壳上展示的药物亲和筛选肽的氨基酸序列。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AFFINIXQN	ULVAC, Inc. (东京，日本)	QCM2008-STKIT	包含玻璃比色皿、搅拌磁子、带Windows操作系统的操作与分析软件
陶瓷传感器芯片	ULVAC, Inc. (东京，日本)	QCMST27C	每包含4个传感器芯片
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich<br/> (密苏里州圣路易斯，美国)	D8418
乙醇	Merck (新泽西州凯尼尔沃思，美国)	09-0850
AFFINIX固定化试剂盒	ULVAC, Inc. (东京，日本)	QCMIMKT	自组装单分子层（SAM）试剂和胺偶联试剂
液体LB培养基	Sigma-Aldrich<br/> (密苏里州圣路易斯，美国)	L3522	高压灭菌20分钟
NaCl	Merck (新泽西州凯尼尔沃思，美国)	S3014
Tris	Merck (新泽西州凯尼尔沃思，美国)	252859