尺寸排阻色谱结合多角度光散射分析蛋白质寡聚体

摘要

来源：Some, D. 等，利用尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（SEC-MALS）对蛋白质进行表征。J. Vis. Exp. （2019）。

本视频介绍了SEC-MALS技术，该技术结合了尺寸排阻色谱法（SEC）和多角度光散射（MALS）的优势。在SEC-MALS中，SEC根据蛋白质或蛋白质复合物的大小对其进行分离，而MALS检测器则通过测量分子在不同角度下散射光的强度，确定其平均分子量。

方案

1. 系统的准备

1. 将MALS和dRI检测器连接在FPLC的UV检测器下游。旁路pH和电导检测器，因为它们会显著增加UV检测器与MALS检测器之间的检测器间体积。从色谱柱到各检测器以及检测器之间使用内径0.25 mm的毛细管，检测器出口至废液或组分收集器则使用内径0.75 mm的毛细管。
2. 确保FPLC与检测器之间的必要信号连接已建立，包括紫外检测器的模拟输出连接至MALS的模拟输入端，以及FPLC的数字输出连接至MALS Autoinject。 通过 FPLC 的 I/O 盒
3. 安装一根合适的分析型SEC色谱柱，其分离范围至少应覆盖20 kDa至500 kDa。请查阅产品说明，确认该色谱柱是否适用于样品及流动相的分子量范围、pH值及其他相关性质。

2. 缓冲液的配制、系统过夜冲洗及清洁度检查

1. 使用高效液相色谱级试剂，配制含 50–100 mM NaCl 的 1 L 磷酸盐缓冲液。使用瓶顶式聚醚砜滤器或类似装置将缓冲液过滤至 0.1 µm。先将前 50–100 mL 缓冲液过滤至废液瓶中并弃去，以去除干燥滤器中的颗粒物，然后将剩余缓冲液过滤至已用过滤去离子水彻底清洗并加盖以防止灰尘进入的洁净无菌瓶中。
   注意：若需分析在其他溶剂中溶解性更优的蛋白质，可....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	快速蛋白液相色谱仪 (FPLC)
AKTA UNICORN	GE Healthcare		FPLC 控制软件
ASTRA	Wyatt Technology		多角度激光散射数据采集与分析软件
牛血清白蛋白（纯度>97%）	Sigma	A1900	分析物
DAWN 或 miniDAWN	Wyatt Technology	WH2 或 WTREOS	WH2 或 WTREOS
Increase 200 10/300	GE Healthcare		尺寸排阻色谱柱，200 Å 孔径，内径 10 mm，长度 300 mm
OptiLab	Wyatt Technology	WTREX	差示折光指数 (RI) 检测器
氯化钠 NaCl	Sigma	71382	高效液相色谱级 NaCl
Stericup 瓶顶过滤器 聚醚砜 0.1 µm 1000 mL	Millipore	Millipore	流动相过滤器
Whatman Anotop 10 注射器过滤器 0.02 µm	GE Healthcare	6809-1002	样品过滤器
Whatman Anotop 10 针头式过滤器，0.1 µm 孔径，直径 10 mm G	GE Healthcare	6809-1012	样品过滤器
Whatman Anotop 25 注射器过滤器 0.1 µm	GE Healthcare	6809-2012	流动相过滤器
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	动态光散射检测器