尺寸排阻色谱结合多角度光散射分析蛋白质寡聚体

摘要

来源：Some, D. 等，利用尺寸排阻色谱-多角度光散射联用技术（SEC-MALS）对蛋白质进行表征。J. Vis. Exp. （2019）。

本视频介绍了SEC-MALS技术，该技术结合了尺寸排阻色谱法（SEC）和多角度光散射（MALS）的优势。在SEC-MALS中，SEC根据蛋白质或蛋白质复合物的大小对其进行分离，而MALS检测器则通过测量分子在不同角度下散射光的强度，确定其平均分子量。

方案

1. 系统的准备

1. 将MALS和dRI检测器连接在FPLC的UV检测器下游。旁路pH和电导检测器，因为它们会显著增加UV检测器与MALS检测器之间的检测器间体积。从色谱柱到各检测器以及检测器之间使用内径0.25 mm的毛细管，检测器出口至废液或组分收集器则使用内径0.75 mm的毛细管。
2. 确保FPLC与检测器之间的必要信号连接已建立，包括紫外检测器的模拟输出连接至MALS的模拟输入端，以及FPLC的数字输出连接至MALS Autoinject。 通过 FPLC 的 I/O 盒
3. 安装一根合适的分析型SEC色谱柱，其分离范围至少应覆盖20 kDa至500 kDa。请查阅产品说明，确认该色谱柱是否适用于样品及流动相的分子量范围、pH值及其他相关性质。

2. 缓冲液的配制、系统过夜冲洗及清洁度检查

1. 使用高效液相色谱级试剂，配制含 50–100 mM NaCl 的 1 L 磷酸盐缓冲液。使用瓶顶式聚醚砜滤器或类似装置将缓冲液过滤至 0.1 µm。先将前 50–100 mL 缓冲液过滤至废液瓶中并弃去，以去除干燥滤器中的颗粒物，然后将剩余缓冲液过滤至已用过滤去离子水彻底清洗并加盖以防止灰尘进入的洁净无菌瓶中。
   注意：若需分析在其他溶剂中溶解性更优的蛋白质，可使用 Tris 缓冲液等其他流动相溶剂。
2. 以 0.5 mL/min 的流速过夜冲洗，或按照色谱柱制造商的建议进行冲洗，以使色谱柱在缓冲液中充分平衡并去除颗粒物。使用 FPLC 的 连续流 模式，并确保在所有 SEC-MALS 运行完成前流速不中断。
   1. 在过夜冲洗期间，将 dRI 流通池置于 冲洗 模式。在开始样品进样前关闭冲洗模式。
   2. 开始冲洗时，应逐步升高流速，以防止因色谱柱内压力突变导致的“柱脱落”现象（或颗粒释放）。
   3. 若系统已知稳定且无颗粒，并已与目标流动相达到平衡，可用较短的 2–3 小时冲洗替代过夜冲洗。
3. 通过轻敲柱后管路以释放积聚的颗粒物，并观察 MALS 仪器前面板显示器上 90° 检测器的信号，检查系统清洁度。确认峰-峰值噪声不超过 50–100 µV。
4. 进行一次“空白”进样，以确认进样器无颗粒污染。“空白”即为在新鲜无菌小瓶中配制的运行缓冲液。
   1. 若颗粒峰体积不超过 1 mL，且高出基线不超过 5 mV，则系统已准备就绪可进行样品分析。否则，需重复进行空白进样直至系统清洁，或执行维护操作以清洁进样器。

3. 样品的制备与上样

1. 在SEC缓冲液中配制至少200 µL、浓度为1–2 mg/mL的BSA溶液。
   注意：为防止沉淀，BSA切勿用纯水溶解。
2. 使用注射器滤器将蛋白溶液过滤至0.02 µm。
3. 弃去滤液的前几滴，以去除干燥滤器中的颗粒物。
4. 或者，将样品在10,000 × g 条件下离心15分钟，使不溶性聚集体及其他大颗粒沉淀。
5. 将100 µL BSA溶液注入进样环。
   注意：此为推荐上样量，可根据样品的稳定性或可获得性等情况适当增减。每次进样的蛋白用量与分子量成反比；若蛋白分子量为33 kDa（即BSA的一半），则所需蛋白质量应加倍。

4. 多角度激光散射软件的准备

1. 打开 新方法 | 实验 从 MALS 软件菜单中的方法中选择 在线 方法来自 光散射 系统方法文件夹。如果存在DLS检测器，则选择 在线 方法来自 光散射 | 采用QELS技术 文件夹
2. 在 配置 切片，设置样品和流动相的参数。
   1. 在 通用泵 观察并设置流速至FPLC中使用的流速。
   2. 在 通用泵 查看， 溶剂 分支 名称 领域，选择 PBS.
   3. 在 注射器 查看， 样本 分支，进入 名称 作为 BSA，并设置 dn/dc = 0.185（未修饰蛋白质的标准值），A2 = 0，紫外消光系数 = 0.667 mL/(mg·cm)。
      注意： 对于其他蛋白质，紫外光₂₈₀ nm消光系数可从文献中查找，或利用多种公共软件工具根据其序列进行计算。
3. 在 实验步骤 切片 基础合集 查看，选中复选框 自动注射触发 将运行时间设置为70分钟，以便在整个洗脱过程中收集数据，直至达到SEC柱的总体积渗透。
   注意： 所需时间可能因色谱柱和流速而异——对于标准的7.8 mm × 300 mm HPLC-SEC色谱柱，在0.5 mL/min流速下，需要收集35分钟。
4. 在MALS软件中，通过点击开始实验 运行 按钮。在接收到FPLC仪器的脉冲信号后，将开始读取数据 通过 多角度激光散射检测器
5. 通过点击将dRI信号归零 自动归零 仪器前面板上的按钮。

5. FPLC 软件的准备

1. 在FPLC软件中，进入手动 | 执行手动指令 | 设置标记，输入蛋白名称和运行编号。
2. 在流路 | 进样阀下，将进样阀从手动加载切换至进样状态。
3. 在I/O盒 | 脉冲数字输出中插入一个0.5秒的脉冲信号，以触发MALS软件中的数据采集。

6. 将样品注入进样环。在FPLC软件中点击“执行”以开始实验运行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AKTA pure	GE Healthcare	29-0182-26	快速蛋白液相色谱仪 (FPLC)
AKTA UNICORN	GE Healthcare		FPLC 控制软件
ASTRA	Wyatt Technology		多角度激光散射数据采集与分析软件
牛血清白蛋白（纯度>97%）	Sigma	A1900	分析物
DAWN 或 miniDAWN	Wyatt Technology	WH2 或 WTREOS	WH2 或 WTREOS
Increase 200 10/300	GE Healthcare		尺寸排阻色谱柱，200 Å 孔径，内径 10 mm，长度 300 mm
OptiLab	Wyatt Technology	WTREX	差示折光指数 (RI) 检测器
氯化钠 NaCl	Sigma	71382	高效液相色谱级 NaCl
Stericup 瓶顶过滤器 聚醚砜 0.1 µm 1000 mL	Millipore	Millipore	流动相过滤器
Whatman Anotop 10 注射器过滤器 0.02 µm	GE Healthcare	6809-1002	样品过滤器
Whatman Anotop 10 针头式过滤器，0.1 µm 孔径，直径 10 mm G	GE Healthcare	6809-1012	样品过滤器
Whatman Anotop 25 注射器过滤器 0.1 µm	GE Healthcare	6809-2012	流动相过滤器
WyattQELS	Wyatt Technology	WIQ	动态光散射检测器