双分子互补亲和纯化，分离两种相互作用的蛋白质

Abstract

来源:Hastings， J. F. et al. 通过双分子互补亲和纯化 （BiCAP） 剖析多蛋白信号转导复合物。J. Vis. Exp. （2018 年）

在本视频中，我们展示了双分子互补亲和纯化 BiCAP，以使用构象特异性单域抗体检测和分离特异性蛋白质二聚体。

Protocol

1. 细胞培养和转染

注意:对于 BiFC 载体的转染，实现高效且相对均一的转染非常重要。载体可能与任何标准转染试剂兼容，转染条件应相应地优化。为了进行质谱分析，我们通常在 10 cm 培养皿内培养细胞，尽管对于需要较少材料的实验，也可以按比例缩小到更小的培养皿或培养板。

1. 将 1.0 ×^{10 个 6} HEK293T 细胞接种在 10 cm 培养皿中，加入 10 mL DMEM 培养基，补充有 10% FBS 和青霉素/链霉素 （1:100）。
2. 将 2.5 μg 每种 BiFC 载体稀释到 1.5 mL 微量离心管中的 500 μL 转染缓冲液中（参见材料表）。
3. 加入 10 μL 转染试剂（参见材料表）。
4. 涡旋混合物 10 秒，然后短暂离心。在室温下孵育 10 分钟。
5. 将 DNA 转染混合物逐滴加入板中。将细胞孵育足够的时间，以便 BiFC 融合蛋白相互作用以及金星折叠和荧光团成熟，通常为 ~8 - 24 h.
   注:金星的激发峰为 515 nm，其峰值发射为 528 nm，尽管这很容易使用用于可视化 GFP 荧光的标准荧光显微镜进行观察。

Materials