双分子互补亲和纯化法分离相互作用的两种蛋白质

摘要

来源：Hastings, J. F. 等. 通过双分子互补亲和纯化（BiCAP）技术解析多蛋白信号复合物. J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们展示了双分子互补亲和纯化（BiCAP）技术，该方法利用构象特异性的单域抗体来检测并分离特定的蛋白质二聚体。

方案

1. 细胞培养与转染

注意：转染BiFC载体时，实现高效率且相对均一的转染至关重要。这些载体可能与任何标准转染试剂兼容，应相应优化转染条件。为进行质谱分析，我们通常在10 cm培养皿中培养细胞，但对于所需材料较少的实验，也可按比例缩小至更小的培养皿或培养板。

1. 在10 cm培养皿中接种1.0 × 10⁶个HEK293T细胞，加入10 mL DMEM培养基，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素溶液（1:100）。
2. 在1.5 mL微量离心管中，将每种BiFC载体各2.5 µg溶于500 µL转染缓冲液中（见材料表）。
3. 加入10 µL转染试剂（见材料表）。
4. 涡旋混合10秒，短暂离心，室温孵育10分钟。
5. 将DNA转染混合物逐滴加入培养皿中。孵育足够时间，以使BiFC融合蛋白发生相互作用，并完成Venus蛋白的折叠及荧光团成熟，通常为~8 - 24小时。
   注意：Venus的激发峰为515 nm，发射峰为528 nm，但使用标准的GFP荧光显微镜设置即可清晰观察。

2. 样品制备

1. 裂解液的制备
   1. 在收集裂解液之前，配制细胞裂解缓冲液 [50 mM Tris-HCl (pH 7.4)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% (v/v) 非离子型去垢剂（参见材料表）]。4 °C 保存。
   2. 在收获前立即向10 mL细胞裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（参见材料表）。将添加了抑制剂的细胞裂解缓冲液置于冰上保存。
   3. 用预冷的PBS洗涤细胞两次。吸除PBS后，加入1 mL预冷的含抑制剂的细胞裂解缓冲液。将培养皿置于冰上，确保缓冲液覆盖整个培养表面。
   4. 冰上孵育约5分钟，然后使用细胞刮刀（参见材料表）刮下细胞，并转移至预冷的1.5 mL微量离心管中。
   5. 将收集的裂解液在4 °C下以18,000 × g 离心5分钟，去除细胞碎片，将澄清的上清液转移至新的微量离心管中。
      注意：此时裂解液可立即使用，或储存于-80 °C。建议保留一份粗裂解液样品，以便后续验证转染效率和亲和纯化效果。
2. 亲和纯化
   注意：BiCAP分离步骤使用与琼脂糖微珠偶联的GFP纳米抗体（参见材料表）进行。
   1. 用1 mL PBS洗涤适量体积的琼脂糖微珠（每样本20 µL + 10 µL余量）。在300 × g 条件下离心，弃去上清液。
   2. 向每个裂解液样本中加入20 µL微珠悬液。
   3. 在4 °C下以末端旋转方式孵育2小时。
      注意：此时样本可用于SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，或进行质谱分析。
3. 用于蛋白质印迹的BiCAP洗脱液制备。
   1. 在300 × g 条件下离心微珠，并用细胞裂解缓冲液洗涤三次。
   2. 将洗涤后的微珠重悬于50 µL适当稀释的上样缓冲液中（参见材料表），并在95 °C加热2–3分钟。
      注意：以此方式制备的样本可在-20 °C保存数月。
   3. 对V1标签和V2标签（参见材料表）以及其他感兴趣的蛋白进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Gibco	11995-073	细胞培养
FBS	Life Technologies Australia	10099-141	细胞培养
青霉素/链霉素	Life Technologies Australia	15070-063	细胞培养
jetPRIME 转染缓冲液	Polyplus	114-15	细胞培养
jetPRIME 转染试剂	Polyplus	114-15	细胞培养
PhosSTOP（磷酸酶抑制剂）	Sigma-Aldrich	4906837001	细胞培养
Complete, Mini, 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11873580001	塑料器皿
细胞刮刀	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	gta-100	偶联琼脂糖微珠的GFP纳米抗体
N端GFP单克隆抗体	Covance	MMS-118P	可检测BiFC载体中的V1标签
C端GFP单克隆抗体	Roche	11814460001	可检测BiFC载体中的V2标签
上样缓冲液	Invitrogen	NP0008	添加1 mL β-巯基乙醇。
测序级修饰胰蛋白酶	Promega Corporation	V5117h	细胞培养
LoBind 微量离心管	Point of Care Diagnostics	0030 108 116	塑料器皿
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	I1149-5G	用超纯水配制成5 mg/mL
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
DH5α 细胞	Thermo Fisher		热激感受态细胞