利用差示扫描量热法研究DNA适配体与热不稳定配体的相互作用

摘要

来源：Mittermaier, A. K., 等 . 利用热不稳定配体测定生物分子DSC谱图以快速表征折叠与结合相互作用。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了差示扫描量热法——一种用于研究生物分子与配体之间相互作用的技术。通过对待测样品施加反复的加热和冷却循环，并获取热力学分析所需的扫描数据，来研究DNA适配体与热不稳定配体之间的结合。

方案

1. 样品制备

1. 纯化目标生物分子。
   注意：本方案使用购买的可卡因结合DNA适配体MN4，在3 kDa截留分子量的离心过滤器中用2 M NaCl置换三次，再用去离子水置换三次后使用。
2. 合成并纯化，或直接购买所需的热不稳定配体。
   注意：MN4可结合热不稳定配体可卡因。MN4也可结合奎宁，后者在此实验温度下用作配体热稳定性的阴性对照。
3. 配制用于纯化后生物分子透析及配体溶解的缓冲液（本实验中MN4及配体使用20 mM磷酸钠、140 mM NaCl、pH 7.4的缓冲液）。
4. 使用截留分子量为0.5–1.0 kDa的透析袋，将生物分子在至少2 L上述缓冲液中进行透析。
5. 将最终缓冲液（称为工作缓冲液）通过已充分平衡的0.2 µm滤膜过滤。
6. 称取所需质量的配体，并将其溶解于过滤后的工作缓冲液中。若所需配体浓度对应的称量质量过小而难以准确称量，可配制高浓度配体储备液（例如10倍浓缩液）。
   注意：所有DSC实验必须使用相同的工作缓冲液处理样品和配体，即，切勿使用与生物分子不同批次的工作缓冲液溶解配体，否则会导致缓冲液不匹配，从而在数据中产生伪影。
7. 将生物分子储备液通过已充分与工作缓冲液平衡的0.2 µm滤膜过滤。
8. 通过吸光度测定确定生物分子浓度（核酸如MN4在260 nm处测定，蛋白质在280 nm处测定）。
9. 将制备好的生物分子和配体储存于4 °C冰箱中（适用于MN4及本实验所用配体）；若生物分子和配体可耐受冷冻且需长期保存，可储存于-20 °C或-80 °C。在装入DSC仪器前，使用台式脱气仪（见材料表）对缓冲液、生物分子和配体溶液进行脱气处理。
   注意：脱气有助于防止DSC在较高温度下产生气泡。气泡会导致信号伪影，掩盖DSC峰形和基线。

2. DSC 样品制备

1. 从DSC上拧下压力手柄（参见材料表）。
2. 将硅胶管从工作缓冲液引出，并连接至参比毛细管的前端法兰（金属开口）。
3. 通过将后端参比法兰连接至前端样品法兰，在参比毛细管和样品毛细管之间建立连接。
4. 在后端样品法兰上连接一段硅胶管，该管通向带有真空管线的废液瓶。
5. 打开真空管线，用200 mL工作缓冲液冲洗DSC系统。
6. 用工作缓冲液填充DSC的参比毛细管。在参比毛细管的法兰上连接约3–5 cm长的硅胶管段。
7. 将1 mL移液器吸头插入后端法兰的硅胶管中。用移液器吸取0.8 mL工作缓冲液，并将装有缓冲液的移液器吸头插入前端参比法兰的硅胶管中。
8. 轻轻按下移液器推杆，使工作缓冲液通过前端硅胶管进入参比毛细管，并上升至后端法兰连接的移液器吸头中。继续下压移液器推杆，直至工作缓冲液液面升至前端硅胶管上方稍高位置，然后缓慢释放推杆，使液面回落至后端硅胶管上方稍高位置。
   1. 重复使工作缓冲液前后流动，以排除参比毛细管内的气泡。
      注意：通常溶液来回流动10次足以清除所有气泡。
9. 用拇指堵住后端移液器吸头，轻轻向上拉起后端和前端移液器，将它们连同硅胶管一起从参比法兰上取下。
10. 按照步骤2.6–2.9的方法，用工作缓冲液加载样品毛细管。在后端参比法兰和样品法兰上安装黑色塑料盖帽，前端法兰保持裸露。
11. 安装压力手柄。
12. 打开DSC软件（参见材料表），待功率读数稳定后，点击界面顶部的红色向上箭头对仪器加压；DSC的功率显示在界面右上角的方框中，同时显示仪器的温度和压力读数。
    注意：在DSC加压过程中需监测功率读数。若功率变化超过约10 µW，表明毛细管中形成气泡，可能导致数据伪影。此时必须取出溶液并进一步脱气后才能继续实验。
13. 通过执行一次正向和反向扫描，使用工作缓冲液对DSC进行平衡。在屏幕左侧的“实验方法”选项卡中，确保已选择“扫描”选项，以使DSC处于温度扫描模式。
    注意：实验参数包括温度扫描范围、扫描速率、高低温平衡时间以及扫描次数。
    1. 在“实验方法”选项卡下的“温度参数”子设置中，点击“加热”按钮。输入下限和上限实验温度分别为1和100 °C，扫描速率为1 °C/min，平衡时间为60 s。
    2. 在平衡时间输入框下方点击“添加序列”按钮。在弹出窗口的“要添加的步数”字段中输入2（用于一次加热和一次冷却扫描），并勾选“交替加热/冷却”选项。点击“确定”；添加的扫描将显示在界面下方区域。检查每项扫描的参数是否符合预期。
    3. 点击界面顶部的绿色“播放”按钮开始实验。在弹出窗口中导航至目标文件夹，并输入用于保存实验数据的文件名。通过点击“实验方法”选项卡右侧的“数据”选项卡查看实验进程。

3. 收集热不稳定配体的DSC数据集

注意： 最小实验流程包括五个实验：缓冲液参比实验（含配体和不含配体，用于基线校正）、游离生物分子样品实验、配体结合态生物分子实验，以及延长高温平衡时间的配体结合态生物分子实验。

1. 运行参考实验以对样品数据进行基线校正。在两个毛细管中重新装入工作缓冲液，以1 °C min-1的速率在适当的温度范围内采集多次正向和反向扫描，高温端平衡时间为120 s。
   1. 通过逐一选中界面下部先前的缓冲液平衡扫描曲线，然后点击界面中右侧的红色“X”按钮，将其删除。点击“Add Series”按钮以添加新的扫描序列，在“Steps to add”字段中输入20，并勾选“Alternate Heating/Cooling”选项框。点击“OK”，然后如上所述点击绿色播放按钮以运行实验。
   2. 用含有目标浓度配体的工作缓冲液在两根毛细管中重复步骤 3.1 - 3.1.1，以获得配体的参考实验数据（分别采用 120 s 和 600 s 的高温平衡时间进行两次独立实验，用于获取热不稳定性配体转化的速率常数）。
      注意： 此处使用的扫描速率可确保后续实验中的生物分子在正向和反向扫描中均处于热力学平衡状态。扫描速率 < 0.1 - 0.2 °C min-1 的升温速率会导致热谱图噪声增加，不适用于DSC实验。温度范围应从游离生物分子熔点以下足够低的温度延伸至配体饱和生物分子熔点以上足够高的温度（对于MN4约为20 - 80 °C）。应验证扫描结果的可重复性（例如，进行10次正向扫描和10次反向扫描，共20次，已足够）。
   3. 若使用多种配体（如可卡因和奎宁），每次运行之间需用200 mL工作缓冲液冲洗DSC（重复步骤2.5），以清除毛细管中的配体并防止交叉污染。
      注意： 进行配体结合实验后，建议对游离生物分子进行一次重复实验，以检查先前使用的配体是否强烈吸附于毛细管壁上，并且未能通过缓冲液冲洗充分去除。若在配体结合实验之后，游离生物分子的热谱图显示出更大的热效应幅度以及更高的变性温度，则表明前一次使用的配体可能在冲洗后仍残留在量热仪中。此时，应通过将毛细管与塑料盖和压力手柄取下后，置于含20% Contrad-70的溶液中，在60 °C下孵育1小时，以去除吸附的配体。在DSC软件中，切换至“实验方法”选项卡，将实验模式更改为“等温”模式，设置持续时间为3,600秒，等温温度为60 °C，平衡时间设为零，点击“添加至实验方法”。该等温实验将显示于屏幕下方区域。实验完成后，使用2 L去离子水冲洗仪器，并从步骤2.5重新开始后续操作。
2. 使用与参考扫描相同的DSC加样程序和实验参数运行样品实验。对于游离生物分子数据集，确保参考毛细管中含有工作缓冲液，而样品毛细管中含有溶于工作缓冲液并达到目标浓度的游离生物分子。
   1. 对于配体结合实验，确保参考毛细管中的工作缓冲液含有配体，而样品毛细管中的工作缓冲液含有生物分子及配体。每次加入不同配体之间，按照步骤2.5冲洗系统。
3. 进行一次额外的实验，将结合了热不稳定配体的生物分子在高温平衡阶段的时间延长至600秒，其余所有实验参数均与步骤3.2.1相同。
   注意： 第二次配体结合实验的高温平衡阶段持续时间的选择，仅需确保配体的消耗速度比短平衡时间实验更快即可。如果第一次实验中的配体结合峰随扫描次数增加而缓慢衰减（例如连续峰最大值之间的差异≤0.5 °C时，应估计将高温平衡期延长10至20倍，以便在第二次实验中充分加速配体的消耗。准确计算配体转化的速率常数要求第二次实验中配体的消耗速度明显快于第一次实验。若第二次实验中配体消耗未得到足够加速，则两次实验经全局分析所得的配体浓度将相近，因而无法用于计算。

4. 数据处理

1. 在DSC数据分析软件中打开DSC实验文件（参见材料表 ），并将原始功率数据导出为电子表格。
2. 将包含原始功率数据的电子表格导入数据拟合软件中。
3. 通过从游离态和配体结合态生物分子实验的功率数据中减去缓冲液的功率数据，对样品数据进行基线校正。
   注意： 对于热不稳定性配体实验，初始配体浓度随着每次扫描逐渐降低。因此，理想的做法是用缓冲液扫描1减去样品扫描1，依此类推。我们发现，随着配体转化的进行，含可卡因的缓冲液扫描数据变化不显著，因此可使用单次热不稳定性配体缓冲液扫描数据来校正所有热不稳定性配体结合态数据。
4. 将基线校正后的样品功率数据转换为热容。
   注意： 此转换需要生物分子的部分比容，该参数可进行估算。

5. 数据分析

1. 使用一组全局的基线、配体浓度、折叠和配体结合参数，对短平衡时间的热不稳定配体结合热容数据集进行全局拟合。
2. 对长平衡时间数据集重复进行全局拟合，以计算热不稳定配体转化的速率常数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Chem Impex	#00829
一水合二水合磷酸二氢钠	Sigma Aldrich	71502
磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	S9763
分子生物学用去离子水	Millipore	H20MB1001
0.2 微米无菌注射器滤器	VWR	CA28145-477
3 kDa 离心滤膜	Millipore	UFC900324
透析袋，截留分子量 0.5–1.0 kDa	Spectrum Laboratories	131048
硅胶管	VWR	89068-474
塑料 DSC 法兰盖	TA Instruments	6111
DNA 适配体 MN4	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/site/order/menu
可卡因	Sigma Aldrich	C008
奎宁	Sigma Aldrich	22620
NanoDSC-III 微量热仪	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun 软件	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze 软件	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70	VWR	89233-152