竞争性结合实验用于鉴定干扰受体-配体相互作用的化合物

摘要

来源：Schoofs, G.，等。一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定干扰荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物。J. Vis. Exp. (2018)。

在本视频中，我们介绍了一种基于流式细胞术的竞争性结合实验方法，用于检测CXC趋化因子受体4（CXCR4）与其荧光标记的天然配体CXC趋化因子配体12（CXCL12）之间的相互作用，该检测在存在靶向CXCR4的小分子化合物的条件下进行。当将表达CXCR4的细胞与较低浓度的小分子共同孵育时，CXCR4与CXCL12仍可发生一定程度的结合；而随着小分子浓度逐步增加，这种结合逐渐减少。

方案

1. 竞争结合实验用CXCL12、测定缓冲液和Jurkat细胞的制备

1. 通过将冻干试剂（储存于 -80 °C，避光）溶解于含有 0.01%（体积/体积）聚山梨酯 20 的超纯水中，配制 CXCL12^AF647 储存液（20 µg/mL；参见材料与试剂表）。将该储存液分装成单次使用量，于 -80 °C 避光保存。
2. 通过向 200 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS，10 倍浓度，不含酚红和碳酸氢钠，最终浓度为 1 倍）中加入 40 mL HEPES（1 M，最终浓度为 20 mM），配制检测缓冲液。加入超纯水至终体积为 2 L。加入 4 g（0.2% 质量/体积）牛血清白蛋白（BSA），并通过磁力搅拌使其完全溶解。最后，用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并使用真空过滤装置经 0.2 µm 滤膜过滤溶液（参见材料与试剂表）。
   注意：此检测缓冲液将在本方案的所有后续步骤中使用。
3. 计数 Jurkat 细胞的数量并检测其活力。取少量细胞悬液，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后进行分析。
   注意：我们常规使用一种可自动分析不同浓度细胞悬液的细胞活力分析仪（参见材料与试剂表）。进行细胞计数时，将 0.5 mL 细胞悬液与 1.5 mL PBS 混合稀释（也可采用其他稀释比例，例如，0.1 mL 细胞悬液加入 1.9 mL PBS）。市面上还有多种可用于细胞数量与活力检测的设备，效果相当。
4. 通过离心（离心机类型参见材料与试剂表），在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，将所需数量的细胞（即，进行一个完整的 96 孔板检测约需 24 × 10⁶ 个细胞）收集至无菌 50 mL 离心管中。
5. 小心倾去上清液，避免扰动细胞沉淀。加入新鲜检测缓冲液（例如，20 mL），通过轻柔吹打重悬细胞。
6. 再次在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。
7. 再次倾去上清液，将细胞沉淀用新鲜检测缓冲液重悬，调整细胞密度至 5 × 10⁶ 个细胞/mL。

2. 竞争性结合实验

注意： 实际的竞争结合实验在室温下进行，且可在非无菌条件下操作。

1. 将待研究的化合物在检测缓冲液（见1.2）中稀释至所需浓度。可选择为初始筛选配制固定浓度的化合物溶液例如， 10 µM 最终浓度），或者 alternatively，采用一系列浓度梯度稀释以对化合物进行更详细的表征（例如， 从1 µM（终浓度）开始的1/3、1/4或1/5倍比稀释系列。请注意，化合物溶液在检测中最终会被稀释2倍，因此应配制2倍浓度的溶液。
2. 将100 µL化合物溶液（2倍浓缩液）加入透明96孔圆底板中（见 材料与试剂表）按照预设的实验设计（例如， 图1C).
   注意在此阶段，将阴性对照和阳性对照样本纳入检测。在该实验中 阴性对照样本，向96孔板的孔中加入100 µL检测缓冲液，代替化合物。对于 阳性对照样本，此步骤中还需加入检测缓冲液。另见 图1C 用于测试多种化合物稀释系列的典型实验设计。
3. 加入50 µL细胞悬液（见1.7；0.25 x 10⁶ 使用多通道移液器将试剂储液槽中的细胞加入96孔板中。在室温避光条件下孵育15分钟。
4. 加入50 µL荧光标记的CXCL12（即， 100 ng/mL CXCL12^AF647 在测定缓冲液中（4倍浓缩，终浓度为25 ng/mL），从类似的试剂储液槽加入至96孔板的各孔中。室温避光孵育30分钟。
   注意： 对于 阴性对照样本，改为加入检测缓冲液。因此，阴性对照样本中检测到的荧光信号将对应于自发荧光背景信号（图1A）。对于 阳性对照样本，每孔加入 50 µL CXCL12^AF647. 阳性对照样品将产生可检测到的最大荧光信号，因为未包含与化合物预孵育可能产生的抑制作用（图1A).
5. 将96孔板在400 x g条件下离心 g 室温孵育5分钟。将培养板倒置，弃去沉淀细胞的上清液。用纸巾将培养板干燥。
6. 使用多通道移液器从试剂储液槽中向各孔加入 200 µL 新鲜测定缓冲液。立即进行下一步操作。
7. 再次以 400 x g 离心 5 分钟 g 室温下，将平板倒置以去除上清液，并在纸巾上再次干燥。
8. 轻轻将细胞沉淀重悬于200 µL含1%多聚甲醛的PBS溶液中。此步骤用于固定细胞。
9. 立即继续进行流式细胞术荧光定量分析。

3. 通过流式细胞术分析样品

CXCL12^AF647 染色和固定的细胞现已准备好使用流式细胞术进行分析。可使用多种类型的流式细胞仪，但必须配备正确的激光器（即， 红色激光（激发波长范围约630 nm）用于激发，并配备适合荧光染料检测的滤光片（发射滤光片约660 nm）。设备需能够处理96孔板格式的样品。适用于本实验的流式细胞仪示例见下文 材料与试剂表.

1. 启动设备并打开相应的软件（参见材料与试剂表）。
2. 选择以下细胞参数，以点图形式显示：前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）以及荧光染料（CXCL12^AF647）检测通道。
   注意：通过FSC参数可根据细胞大小区分细胞，因为检测到的光吸收强度与细胞直径成正比。SSC参数测量的是90°角方向的光散射，可提供有关细胞颗粒度的信息。
3. 选择一个样本（例如，阴性对照样本），根据FSC和SSC参数对定义的均一细胞群进行设门。
   1. 选择从此阴性对照样本中自动进样约100 µL固定后的细胞进入流式细胞仪。进样前选择“混匀”选项，并使用1.5 µL/s的样本流速。
   2. 点击“采集数据”运行该样本。该样本的FSC和SSC参数将显示在屏幕上。
   3. 选择软件中的设门工具。根据FSC和SSC点图显示，通过设门预先定义一个均一且具有活性的细胞群体。具体操作为：使用软件设门工具绘制一个多边形区域，包含在这两个参数维度上分布均一的单个细胞（“事件”）。
      注意：设门的目的是定义一个均一且具有活性的细胞群体，用于后续分析。该步骤基于以下假设：大多数活细胞在FSC和SSC参数上会形成一个均一的细胞群。通过此步骤可基本排除细胞碎片、死亡细胞和细胞聚集体对后续分析的干扰。图1B展示了设门过程的示意图。
4. 选择每样本分析20,000个“事件”（即单个细胞）。
   注意：这意味着每个样本中，最终将分析20,000个位于预设门控区域内的细胞。每个样本的数据采集将持续进行，直至达到该事件数量。
5. 开始运行（选择“记录数据”）。流式细胞仪将逐个分析所有样本，并记录每个样本的平均荧光强度（MFI）。该MFI值对应于落在预设门控区域内的20,000个细胞所产生的平均荧光信号。

结果

图1：实验流程概览及所获数据类型的示意图。（A）针对阴性对照、阳性对照及化合物处理样本，示意图展示了本实验方案的主要步骤。未进行化合物预孵育且未添加荧光标记趋化因子（CXCL12^AF647）的样本用于测定背景（自发）荧光信号（阴性对照样本）。未进行化合物预孵育但添加固定量CXCL12^AF647的样本用于测定实验中的最大结合信号（阳性对照样本）。在化合物处理样本中，细胞先与化合物预孵育，再加入固定量的CXCL12^AF647。（B）通过流式细胞术分析Jurkat细胞，测定平均荧光结合信号。在分析的所有事件（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD FACSCanto II	Becton Dickinson	不适用	流式细胞仪设备
BD FACSDIVA 软件
BD FACSArray	Becton Dickinson	不适用	流式细胞仪设备
BD FACSArray 系统软件
快速流过滤器：0.2 μm aPES 	Thermo Scientific 	566-0020
FlowJo	FlowJo 现为 BD 全资子公司。
Vi-CELL	Beckman Coulter	不适用	细胞活力分析仪
Sigma 3-18 KS	Sigma	不适用	离心机
AMD3100	Sigma	A5602-5mg	特异性 CXCR4 拮抗剂
h-SDF1a (AF647)	ALMAC	CAF-11-B-01	荧光标记的 CXCL12，CXCL12AF647
Sterilin 微孔板，96 孔，U<br/> 底，透明	Thermo Scientific	611U96
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma	A1933-25G
HBSS (10x)，含钙、镁，不含酚红	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Jurkat 细胞	ATCC
PP 试剂储液槽	Sigma	BR703411
Falcon 管，50 ml	Greiner Bio-One	227 261