竞争性结合实验用于鉴定干扰受体-配体相互作用的化合物

摘要

来源：Schoofs, G.，等。一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定干扰荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物。J. Vis. Exp. (2018)。

在本视频中，我们介绍了一种基于流式细胞术的竞争性结合实验方法，用于检测CXC趋化因子受体4（CXCR4）与其荧光标记的天然配体CXC趋化因子配体12（CXCL12）之间的相互作用，该检测在存在靶向CXCR4的小分子化合物的条件下进行。当将表达CXCR4的细胞与较低浓度的小分子共同孵育时，CXCR4与CXCL12仍可发生一定程度的结合；而随着小分子浓度逐步增加，这种结合逐渐减少。

方案

1. 竞争结合实验用CXCL12、测定缓冲液和Jurkat细胞的制备

1. 通过将冻干试剂（储存于 -80 °C，避光）溶解于含有 0.01%（体积/体积）聚山梨酯 20 的超纯水中，配制 CXCL12^AF647 储存液（20 µg/mL；参见材料与试剂表）。将该储存液分装成单次使用量，于 -80 °C 避光保存。
2. 通过向 200 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS，10 倍浓度，不含酚红和碳酸氢钠，最终浓度为 1 倍）中加入 40 mL HEPES（1 M，最终浓度为 20 mM），配制检测缓冲液。加入超纯水至终体积为 2 L。加入 4 g（0.2% 质量/体积）牛血清白蛋白（BSA），并通过磁力搅拌使其完全溶解。最后，用 NaOH 调节 pH 至 7.4，并使用真空过滤装置经 0.2 µm 滤膜过滤溶液（参见材料与试剂表）。
   注意：此检测缓冲液将在本方案的所有后续步骤中使用。
3. 计数 Jurkat 细胞的数量并检测其活力。取少量细胞悬液，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后进行分析。
   注意：我们常规使用一种可自动分析不同浓度细胞悬液的细胞活力分析仪（参见材料与试剂表）。进行细胞计数时，将 0.5 mL 细胞悬液与 1.5 ....

结果

图1：实验流程概览及所获数据类型的示意图。（A）针对阴性对照、阳性对照及化合物处理样本，示意图展示了本实验方案的主要步骤。未进行化合物预孵育且未添加荧光标记趋化因子（CXCL12^AF647）的样本用于测定背景（自发）荧光信号（阴性对照样本）。未进行化合物预孵育但添加固定量CXCL12^AF647的样本用于测定实验中的最大结合信号（阳性对照样本）。在化合物处理样本中，细胞先与化合物预孵育，再加入固定量的CXCL12^AF647。（B）通过流式细胞术分析Jurkat细胞，测定平均荧光结合信号。在分析的所有事件（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD FACSCanto II	Becton Dickinson	不适用	流式细胞仪设备
BD FACSDIVA 软件
BD FACSArray	Becton Dickinson	不适用	流式细胞仪设备
BD FACSArray 系统软件
快速流过滤器：0.2 μm aPES 	Thermo Scientific 	566-0020
FlowJo	FlowJo 现为 BD 全资子公司。
Vi-CELL	Beckman Coulter	不适用	细胞活力分析仪
Sigma 3-18 KS	Sigma	不适用	离心机
AMD3100	Sigma	A5602-5mg	特异性 CXCR4 拮抗剂
h-SDF1a (AF647)	ALMAC	CAF-11-B-01	荧光标记的 CXCL12，CXCL12AF647
Sterilin 微孔板，96 孔，U<br/> 底，透明	Thermo Scientific	611U96
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma	A1933-25G
HBSS (10x)，含钙、镁，不含酚红	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Jurkat 细胞	ATCC
PP 试剂储液槽	Sigma	BR703411
Falcon 管，50 ml	Greiner Bio-One	227 261