基于ELISA的报告基因检测法研究BW细胞中的受体-配体相互作用

摘要

来源：Elias, S. 等，一种用于研究受体-配体相互作用的BW报告系统。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了基于报告基因检测的受体-配体相互作用分析方法。成功的受体-配体相互作用会激活下游信号通路，导致细胞产生并释放细胞因子作为溶液中的分泌型报告分子，随后通过ELISA进行检测确认。

方案

1. 表达嵌合构建体的质粒的构建

注意：目的是构建一种质粒，该质粒表达目的受体的胞外域，并将其与小鼠 CD3ζ 链的跨膜区和胞内区融合（图 1A）。

1. 获取目标受体胞外域的序列，包括信号肽。获得预期可表达该受体的DNA材料例如， cDNA 或质粒）。
2. 获取表达小鼠 CD3ζ 链跨膜区和胞内区的 DNA 材料（例如cDNA 或质粒）
3. 根据所示的融合蛋白通用结构设计其序列 图1A确保整个序列处于同一密码子阅读框内。该序列用于设计合适的引物并验证最终产物。
4. 设计两对PCR反应，分别扩增融合蛋白的每一段片段图1B, 1C).
   注意： PCR反应的具体条件（例如引物的性质（取决于为特定受体设计的引物）会影响延伸时间与退火温度。
   1. 扩增受体的胞外段。
      1. 设计一个5'引物，其中包含受体信号肽的一部分、Kozak共有序列以及一个合适的限制性酶切位点（图1B).
      2. 设计一个位于融合蛋白两部分外侧的3'引物（图1B例如，在初始设计中，该3'引物可包含受体胞外段的最后20个碱基对以及CD3ζ段的前9个碱基对。
         注意： 无需在3'引物上添加限制性酶切位点，因为该引物用于生成融合序列，不用于连接反应。
   2. 扩增 CD3ζ 片段。
      1. 设计一个位于融合蛋白两部分外侧的5'引物（图1C例如，在初始设计中，5'端引物可包含受体胞外段的最后9个碱基对以及CD3ζ段的前20个碱基对。
         注意： 由于该引物用于生成融合序列，而不用于连接反应，因此无需在5'引物中添加限制性酶切位点。
      2. 设计一个3'引物，该引物应包含CD3ζ序列的末端以及一个合适的限制性酶切位点（图1C).
   3. 校正这两个反应中的引物序列，使每对反应的退火温度相近（注意：该引物包含融合蛋白两部分的序列，在每个反应中仅与部分序列退火）。
5. 使用前两轮PCR产物的混合物作为DNA模板，以外部受体区段的5'引物（步骤1.4.1.1）和CD3ζ区段的3'引物（步骤1.4.2.2）进行一次额外的PCR反应图1D）。该反应应生成最终的融合序列。
6. 按照常规克隆步骤进行操作。
   1. 将最终的PCR产物连接至目标切割载体（目标载体通常为pcDNA3，可表达G418和氨苄青霉素抗性）。
   2. 将连接后的载体转化至感受态细菌中。
      1. 将50 µL感受态细菌冰上解冻。
      2. 将连接后的载体加入细菌中，冰上孵育 20 分钟。
      3. 在 42 °C 下孵育 45 秒。
      4. 加入200 µL不含抗生素的LB培养基。
      5. 37 °C下持续振荡孵育1小时。
      6. 在含有适当抗生素的LB平板上接种例如，含终浓度为 0.1 mg/mL 的氨苄青霉素溶液。
   3. 在15 mL离心管中，收集并培养数个细菌菌落在5 mL LB培养基中。
   4. 第二天，使用质粒小提试剂盒提取质粒。
   5. 用限制性内切酶分析基因插入片段。
   6. 对相关菌落进行测序，验证序列及读码框正确（如步骤1.3所述）。
7. 将验证后的质粒转化至感受态细菌中。
   1. 将20 µL感受态细菌置于冰上解冻。
   2. 将1 µL质粒加入细菌中，冰上孵育20分钟。
   3. 在 42 °C 下孵育 45 秒。
   4. 加入200 µL不含抗生素的LB培养基。
   5. 37 °C下持续振荡孵育1小时。
   6. 在含有适当抗生素的细菌生长平板上接种菌种例如，含终浓度为 0.1 mg/mL 的氨苄青霉素溶液。
8. 第二天，在含0.1 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基（约250 mL）中培养细菌菌落。
9. 第二天，根据试剂盒提供的具体说明进行大提粒。
   注意： 电穿孔实验需要大量质粒，具体如下所述。

2. 将表达嵌合蛋白的质粒转染至BW细胞

注意：也可采用其他方法进行转染（例如，通过慢病毒感染）。在电穿孔之前，按以下所述对DNA进行乙醇沉淀。后续步骤需在无菌条件下进行。

1. 前一天，将 BW5147 细胞（“BW 细胞”）制备用于电穿孔。将 10 个 10 cm 培养皿每皿加入 10 mL 含 100,000 个 BW5147 细胞/mL 的细胞悬液进行铺板即， 总共 10 x 10⁶ 细胞用添加了10%胎牛血清（FCS）、1%丙酮酸钠、1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和1%青霉素-链霉素的RPMI培养基（“完全培养基”）悬浮。
2. 将表达融合蛋白的 pcDNA3 质粒 100 µg 置于 1.5–2 mL 离心管中，加入 pH 5.3–5.5 的 3 M 醋酸钠溶液。醋酸钠溶液的体积应为 100 µg 质粒溶液体积的 0.1 倍（即 10%）；使用 pH 计，通过添加 NaOH 或 HCl 调节醋酸钠溶液的 pH 值。
3. 将2.5倍体积的100%乙醇加入质粒与乙酸钠的混合物中（总体积为质粒和乙酸钠体积之和的2.5倍），具体操作如步骤2.2所述。在-20 °C下孵育过夜，或在70 °C下孵育2小时。
4. 在BW细胞接种后24小时，将所有BW细胞（约100 mL）收集至2个50 mL离心管中。在515 × g条件下离心5分钟。 g 弃去上清液。
5. 将两个管中的沉淀物合并，用25 mL RPMI- 培养基重悬于一个50 mL离心管中。例如，先用25 mL RPMI- 培养基重悬其中一个管的沉淀物，然后将此液体用于重悬另一个50 mL管中的沉淀物，从而使BW细胞的总沉淀物最终在单个管中以25 mL培养基重悬。
   注意： 培养基不应添加任何成分，因为血清可能干扰电穿孔。
6. 再次以 515 x g 离心细胞 5 分钟 g将沉淀重悬于1 mL RPMI中，并将悬液转移至冰上的0.4 cm比色皿中。
7. 将经过乙醇沉淀的质粒（步骤 2.3）在 16,000 x g 条件下离心 30 分钟 g 和 4 °C。
8. 用1 mL 70%乙醇洗涤一次，再于16,000 x g离心20分钟 g 以及 4 °C（用于洗去盐分）。
9. 去除全部乙醇，让沉淀物略微干燥（即， 在组织培养罩内的敞口试管中，用100 µL预热至60 °C的RPMI重悬沉淀。
10. 将重悬的质粒（步骤 2.8）加入电转杯中的细胞，冰上孵育 5 分钟。
11. 在0.23 kV、250电容条件下对细胞进行电穿孔，持续时间约为4毫秒。
12. 将电穿孔后的细胞转移至50 mL离心管中，加入50 mL完全培养基，于5,15 × g下离心5分钟 g.
13. 弃去上清液，用50 mL完全培养基重悬细胞。
14. 将电穿孔后的细胞接种于24孔培养板中（每孔1 mL，共约50孔），在37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 48 小时。
15. 使用抗生素筛选转染细胞。转染48小时后，向每孔加入1 mL含10 mg/mL G418的完全培养基（此时每孔终体积为2 mL，G418的终浓度为5 mg/mL）。
    注意： 如果质粒含有不同的抗生素抗性基因，在进行此步骤之前，需确定杀死未转染的BW细胞所需的抗生素浓度。
16. 每48小时，小心弃去每孔上层1 mL培养基，注意不要搅动孔内培养液（BW细胞倾向于沉在孔底）。向每孔中加入含5 mg/mL G418的完全培养基，使每孔终体积再次达到2 mL。
17. 定期检查培养板中所有孔的细胞生长情况。
    注意： 培养基颜色变为黄色可能有助于识别正在生长的细胞；然而在初期，培养基会因G418本身而呈黄色。需识别出阳性孔（即有细胞生长的孔），这些孔中的细胞具有G418抗性，因此预期可表达融合蛋白。该过程通常需要约3周。

3. 验证转染受体在阳性孔细胞中的表达。

1. 使用针对转染受体的特异性抗体对转染的 BW 细胞进行染色。
2. 通过流式细胞术比较转染受体的表达水平与对照细胞（未转染的 BW 细胞）的表达水平。
3. 在验证一个或多个孔后，立即使用细胞进行实验，或将细胞继续培养，或冻存以备将来使用。
4. 在开展新的实验前，需验证转染受体的表达。经过数周培养后，对于已稳定表达受体的细胞，可从培养基中去除 G418。

4. 转染BW细胞与靶细胞的共孵育

注意：首次使用转染的 BW 细胞时，最好用表达目的受体已知配体的靶细胞，或用包被在平板上的特异性针对目的受体的抗体（交联实验；见下文第 4.2.1.3 节）对其进行测试。

1. 建议在实验前 24 小时传代 BW 细胞（例如，在新的 10 cm 培养皿中，向 2 mL 培养细胞中加入 10 mL 完全培养基）。
2. 将转染的 BW 细胞与其靶细胞共同孵育。同时对表达空载体的对照 BW 细胞（或亲本 BW 细胞）进行实验。优先使用 96F 板（但也可使用 96U 板）。实验需设三个重复。所有细胞均悬浮于完全培养基中。
   1. 准备靶细胞。靶细胞的类型根据实验目的而定，可以是细胞、预先与抗体共孵育的细胞，或单独的抗体。该系统也已用于以细菌作为靶细胞的实验。
      1. 若靶细胞为增殖性细胞（即细胞系），在检测前以 6,000 rad 剂量辐照。将 50,000 个靶细胞加入 96 孔板的单个孔中（体积为 100 µL）。
      2. 对于使用抗体及表达人源 FcγR 的 BW 细胞的实验，将靶细胞与抗体在冰上于 96 孔板中孵育（例如，50 µL 靶细胞与 50 µL 抗体混合；可测试不同浓度的抗体）。
      3. 若单独使用抗体作为靶标（交联实验），应将抗体包被于孔板表面。为此，首先在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下，将抗体溶于完全培养基中，在 96F 板中孵育 1–2 小时（通常起始剂量为 50 µL 中含 0.5 μg 特异性抗体）。孵育后洗涤孔板以去除未结合的抗体。
         注意： 此情况下，96F 板可促进抗体与孔板的结合，随后加入转染的 BW 细胞后，可激活所转染的受体。
   2. 加入 BW 细胞（效应细胞）。将 50,000 个 BW 细胞加入 96 孔板的单个孔中（体积为 100 µL）。
   3. 如有需要，将每孔总体积补至 200 µL。
   4. 将培养板在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 48 小时（此时间可根据需要进行调整）。
3. 孵育 48 小时后，将培养板在 -20°C 冻存，ELISA 检测前解冻，或直接用于 ELISA 检测（见下一步骤）。

5. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

1. 用抗小鼠 IL-2 抗体（anti-mIL-2）包被 ELISA 板。每孔加入 50 µL 1x PBS（磷酸盐缓冲液）中含有 0.05 µg 的 anti-mIL-2。将包被好的 ELISA 板在 4 °C 下孵育过夜，或在 37 °C 下孵育 2 小时。
   注意：若要在孵育步骤结束后立即进行 ELISA 检测，应在 BW 细胞孵育结束前 24 小时包被 ELISA 板。
2. 弃去 ELISA 板中的液体，每孔加入 200 µL 封闭液（由 1x PBS 和 1% 牛血清白蛋白（BSA）组成）。室温孵育 2 小时。
3. 用 0.05% PBS Tween 溶液洗涤 ELISA 板三次（即，在 1 升 1x PBS 中加入 0.5 mL Tween-20）。
4. 取出已与靶细胞共孵育的 BW 细胞所在的 96 孔板（4.3）。若该板曾冷冻保存，需完全解冻（例如，短暂在 37 °C 下孵育）。将 96 孔板离心（5 分钟，515 x g），然后小心吸取每孔上清液 100 µL，转移至已包被并封闭的 ELISA 板中。
   注意：应从每孔边缘吸取上清液，以避免吸取细胞。
5. 如需建立 mIL-2 标准曲线，可在包被的 ELISA 板中空出的一行孔中加入已知浓度的重组 mIL-2。例如，起始 mIL-2 浓度为 2,500 pg/mL，随后每孔浓度递减 50%；最后一孔不加 mIL-2。
6. 将 ELISA 板在 4 °C 下孵育过夜，或在 37 °C 下孵育 2 小时。
7. 用 PBS Tween 溶液洗涤 ELISA 板四次。
8. 向 ELISA 板中加入生物素标记的抗小鼠 IL-2 抗体。使用浓度为 1 µg 抗体溶于 1 mL 含 1% BSA 的 1x PBS 中，每孔加入 100 µL。
9. 室温孵育 1 小时。
10. 用 PBS Tween 溶液洗涤 ELISA 板六次。
11. 加入 HRP 标记的链霉亲和素。使用浓度为 1 µL 链霉亲和素溶于 1 mL 含 1% BSA 的 PBSX1 中，每孔加入 100 µL。
12. 室温孵育 30 分钟。
13. 用 PBS Tween 溶液洗涤 ELISA 板六次。
14. 每孔加入 100 µL TMB 底物溶液。此步骤应迅速完成，以尽量减少因加样时间差导致的孔间信号差异。
15. 使用 ELISA 酶标仪在 650 nm 波长读取 ELISA 板（若信号较弱，可重复读数）。

结果

图1：嵌合受体-CD3ζ的结构及PCR引物的设计。 （A）细胞外受体与小鼠CD3ζ跨膜区及胞内区结构域融合的一般结构。（B）使用一个3'引物扩增受体的胞外结构域，该引物还包含CD3ζ的部分核苷酸序列。（C）使用一个5'引物扩增CD3ζ的胞内区和跨膜区结构域，该引物还包含受体的部分核苷酸序列。（D）在最终的PCR反应中，将上述两个具有重叠序列的片段作为DNA模板使用。在所有图示中，不同的蛋白质结构域以不同颜色标注，并用蓝色矩形框（CD3ζ序列）和红色矩形框（受体序列）标出。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AccuPrep 质粒小量提取试剂盒	Bioneer	K-3030
抗小鼠 IL-2 抗体	BioLegend	503702
生物素标记抗小鼠 IL-2 抗体	BioLegend	503804
ELISA 板	De-groot	60-655061
胎牛血清	Sigma	F7524-500ml
G418	Mercury	MBS3458105GM
Gene Pulser II 电穿孔仪	Bio-Rad	165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-谷氨酰胺	Biological industry	03-020-1B
MEM 非必需氨基酸溶液	Biological industry	01-340-1B
青霉素-链霉素溶液	Biological industry	03-031-1B
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素	Jackson ImmunoResearch	016-030-084
PureLink HiPure 质粒滤膜型大提纯试剂盒	ThermoFisher Scientific	K210016
RPMI-1640 培养基	Biological industry	30-2001
丙酮酸钠	Biological industry	03-042-1B
TMB 显色底物	SouthernBiotech	0410-01