基于ELISA的报告基因检测法研究BW细胞中的受体-配体相互作用

摘要

来源：Elias, S. 等，一种用于研究受体-配体相互作用的BW报告系统。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了基于报告基因检测的受体-配体相互作用分析方法。成功的受体-配体相互作用会激活下游信号通路，导致细胞产生并释放细胞因子作为溶液中的分泌型报告分子，随后通过ELISA进行检测确认。

方案

1. 表达嵌合构建体的质粒的构建

注意：目的是构建一种质粒，该质粒表达目的受体的胞外域，并将其与小鼠 CD3ζ 链的跨膜区和胞内区融合（图 1A）。

1. 获取目标受体胞外域的序列，包括信号肽。获得预期可表达该受体的DNA材料例如， cDNA 或质粒）。
2. 获取表达小鼠 CD3ζ 链跨膜区和胞内区的 DNA 材料（例如cDNA 或质粒）
3. 根据所示的融合蛋白通用结构设计其序列 图1A确保整个序列处于同一密码子阅读框内。该序列用于设计合适的引物并验证最终产物。
4. 设计两对PCR反应，分别扩增融合蛋白的每一段片段图1B, 1C).
   注意： PCR反应的具体条件（例如引物的性质（取决于为特定受体设计的引物）会影响延伸时间与退火温度。
   1. 扩增受体的胞外段。
      1. 设计一个5'引物，其中包含受体信号肽的一部分、Kozak共有序列以及一个合适的限制性酶切位点（图1B).
      2. 设计一个位于融合蛋白两部分外侧的3'引物（

结果

图1：嵌合受体-CD3ζ的结构及PCR引物的设计。 （A）细胞外受体与小鼠CD3ζ跨膜区及胞内区结构域融合的一般结构。（B）使用一个3'引物扩增受体的胞外结构域，该引物还包含CD3ζ的部分核苷酸序列。（C）使用一个5'引物扩增CD3ζ的胞内区和跨膜区结构域，该引物还包含受体的部分核苷酸序列。（D）在最终的PCR反应中，将上述两个具有重叠序列的片段作为DNA模板使用。在所有图示中，不同的蛋白质结构域以不同颜色标注，并用蓝色矩形框（CD3ζ序列）和红色矩形框（受体序列）标出。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AccuPrep 质粒小量提取试剂盒	Bioneer	K-3030
抗小鼠 IL-2 抗体	BioLegend	503702
生物素标记抗小鼠 IL-2 抗体	BioLegend	503804
ELISA 板	De-groot	60-655061
胎牛血清	Sigma	F7524-500ml
G418	Mercury	MBS3458105GM
Gene Pulser II 电穿孔仪	Bio-Rad	165-2105, 165-2106, 165-2107, 165-2108, 165-2109, 165-2110
L-谷氨酰胺	Biological industry	03-020-1B
MEM 非必需氨基酸溶液	Biological industry	01-340-1B
青霉素-链霉素溶液	Biological industry	03-031-1B
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素	Jackson ImmunoResearch	016-030-084
PureLink HiPure 质粒滤膜型大提纯试剂盒	ThermoFisher Scientific	K210016
RPMI-1640 培养基	Biological industry	30-2001
丙酮酸钠	Biological industry	03-042-1B
TMB 显色底物	SouthernBiotech	0410-01