生物膜力探针定量受体-配体相互作用

摘要

来源：Chen, Y., 等，荧光生物膜力探针：单细胞水平受体-配体动力学与结合诱导的细胞内信号通路的同步定量分析。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，使用生物膜力探针（BFPs）来测量受体与配体之间的相互作用力。该技术通过监测破坏探针微球上偶联的pMHC与靶细胞上的TCR之间结合所需的压强，从而检测分子间的相互作用。

方案

1. 人红细胞的分离、生物素标记及渗透压调节

注意： 步骤 1.1 应由经过培训的医疗专业人员（如护士）按照经机构审查委员会批准的方案进行操作。

1. 从指尖采血获取 8-10 µl（一滴）血液，加入 1 ml 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中（材料清单）。轻轻涡旋或吹打混匀，于 900 × g 离心 1 分钟。弃去上清液，再洗涤一次。
2. 在小烧杯中称取 3.5–4 mg 生物素-PEG3500-NHS 连接剂（材料清单），用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液溶解，配制成终浓度为 3 mg/ml 的溶液。
3. 将 171 µl 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液、10 µl 红细胞悬液和 1049 µl 生物素-PEG3500-NHS 连接剂溶液混合，室温孵育 30 分钟。用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液洗涤红细胞一次，再用 N2-5% 缓冲液（材料清单）洗涤两次。
4. 同时，将连接剂瓶盖略微松开，放入底部装有干燥剂的玻璃真空干燥器中，抽真空 5 分钟后充入氩气。拧紧瓶盖并取出瓶子，用塑料封口膜（材料清单）密封，置于底部装有干燥剂的容器中，于 -20 °C 保存。
   注意：涉及使用生物素-PEG3500-NHS 连接剂的操作步骤（包括 1.2–1.4，但 1.3 中的孵育和洗涤除外）应尽快完成。
5. 将制霉菌素用 N2-5% 缓冲液稀释至终浓度为 40 µg/ml。取 5 µl 生物素标记的红细胞与 71.4 µl 制霉菌素溶液（材料清单）混合，0 °C 孵育 1 小时。用 N2-5% 缓冲液洗涤两次，然后用含 0.5% BSA（材料清单）的 N2-5% 缓冲液重悬，于冰箱（4 °C）中保存。

2. 玻璃珠硅烷化

1. 珠子表面清洗
   1. 称取50 mg玻璃珠粉末，并将其重悬于500 µl去离子水中。
   2. 在50 ml烧杯中混合0.5 ml 30% H₂O₂（材料清单）与9.5 ml去离子水，然后加入2 ml浓NH₄OH（材料清单），将该溶液置于加热板上加热至沸腾。
   3. 将玻璃珠加入沸腾溶液中，继续煮沸5分钟，每隔1分钟轻轻摇动溶液。
   4. 煮沸后，将约5 ml热珠悬液转移至15 ml离心管中，用室温去离子水补足体积。在3,500 × g下离心5分钟，移除并弃去上清液。
   5. 再转移5 ml热珠悬液加入已清洗的珠子中，补充更多去离子水，充分混匀后再次离心。重复此步骤，直至总共使用约50 ml去离子水，共洗涤4至5次。
   6. 将珠悬液转移至1 ml小瓶中。用甲醇（材料清单）重复洗涤珠子3次，每次在17,000 × g下离心5分钟，最后将珠子重悬于1 ml 100%甲醇中。
2. 珠子表面巯基化
   1. 向50 ml离心管中加入45.6 ml甲醇、0.4 ml乙酸（材料清单）、1.85 ml去离子水、1.15 ml 3-巯基丙基三甲氧基硅烷（MPTMS）（材料清单）以及1 ml步骤2.1制备的珠悬液，室温孵育3小时。
   2. 反应结束后，用新鲜甲醇洗涤一次以去除所有反应物，将珠子重悬于500 µl甲醇中。将该浓缩玻璃珠悬液均匀分装至一组20个干燥洁净的带螺口盖玻璃小瓶中。用干燥氩气吹扫以蒸发甲醇，同时缓慢旋转小瓶，使珠子在瓶壁上形成一层均匀的干燥薄膜。
   3. 将装有珠子的小瓶放入预热至120 °C的烘箱中加热5分钟，取出后迅速将瓶盖松松盖上。将小瓶置于底部装有干燥剂的玻璃真空干燥器中，用真空泵抽真空直至冷却。
   4. 用干燥氩气吹扫已抽真空的干燥器，使其恢复至常压。打开干燥器盖子，迅速将小瓶盖重新拧紧。用塑料封口膜密封小瓶，并在干燥避光的储存盒中室温保存。
   5. 使用时，取其中一瓶干燥珠子，用磷酸盐缓冲液（材料清单）洗涤一次，重悬于50 µl磷酸盐缓冲液中，4 °C保存。此浓缩珠子制剂在后续步骤中称为“MPTMS珠子”。
      注意：若储存得当，MPTMS珠子的功能可保持长达三个月。

3. 磁珠功能化

1. 在微珠上共价包被蛋白质
   1. 取一定体积的蛋白质储备液（例如，2.5 µl），与等体积的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液混合，制成溶液1。
      注意：体积取决于蛋白质储备液的浓度以及期望在微珠表面达到的蛋白位点密度。
   2. 在小烧杯中称取 2–3 mg 的 MAL-PEG3500-NHS 连接剂（材料清单），用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液溶解，使其终浓度为 0.231 mg/ml。
   3. 将溶液1与等体积步骤 3.1.2 中配制的连接剂溶液混合，室温孵育 30 分钟，制成溶液2。
   4. 同时，将连接剂瓶盖略微松开，放入底部装有干燥剂的玻璃真空干燥器中，抽真空 5 分钟后，向干燥器中充入氩气。拧紧瓶盖，取出瓶子，用塑料封口膜密封，放入底部装有干燥剂的容器中，于 -20 °C 保存。
      注意：涉及使用 MAL-PEG3500-NHS 连接剂的操作步骤（包括 3.1.2–3.1.4，但 3.1.3 中的孵育除外）应尽快完成。
   5. 取 5 µl MPTMS 微珠与溶液2混合，加入磷酸盐缓冲液（材料清单），调整终体积至 250 µl。
   6. 室温孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，重悬于 100 µl 磷酸盐缓冲液中，于 4 °C 保存。
2. 制备蛋白质/链霉亲和素（SA）包被的微珠
   1. 按照步骤 3.1.1–3.1.4 操作。
   2. 取 5 µl MPTMS 微珠与溶液2以及 5 µl 浓度为 4 mg/ml 的链霉亲和素-马来酰亚胺（SA-MAL）（材料清单）溶液混合，再加入磷酸盐缓冲液，调整终体积至 250 µl。
   3. 室温孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，最后重悬于 100 µl 磷酸盐缓冲液中，于 4 °C 保存。
3. 在玻璃微珠上包被链霉亲和素
   1. 取 5 μl MPTMS 微珠与 5 μl 浓度为 4 mg/ml 的 SA 溶液混合，加入 140 μl 磷酸盐缓冲液。
   2. 室温孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，重悬于 50 μl 磷酸盐缓冲液中，于 4 °C 保存。
4. 用生物素化蛋白包被 SA 包被的微珠
   1. 取 5 µl SA 包被的微珠与蛋白（体积根据期望的包被密度确定）混合，加入磷酸盐缓冲液，调整终体积至 100 µl。
   2. 于 4 °C 孵育过夜，或于室温孵育 3 小时，用磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，重悬于 50 µl 磷酸盐缓冲液中，于 4 °C 保存。

4. 细胞制备

注意：为纯化细胞，请遵循与所用细胞类型相对应的标准细胞纯化方案，例如T细胞或特定细胞系。

1. 进行fBFP实验时，细胞悬液制备完成后，加入溶于DMSO的Fura2-AM（材料列表），使终浓度为2 µM，室温孵育30分钟，然后洗涤一次。将标记荧光的细胞悬液避光保存，直至使用。

5. 微量移液器和细胞腔室的准备

1. 制备微移液管
   1. 使用玻璃切割器将长玻璃毛细管（材料清单）切割成约3英寸长的短段。将一段毛细管安装到微移液管拉制仪（材料清单）上，点击“拉制”按钮，使仪器加热毛细管中部，并从两端拉伸，从而形成两根具有尖锐末端的毛细管（原始微移液管）。
      注意：根据产品指南，理想的原始移液管应具有6–8 mm的锥形段和0.1–0.5 µm的尖端。
   2. 将一根原始微移液管安装至微移液管成型器（材料清单）的移液管夹持器上。加热以熔化成型器上的玻璃球。将原始微移液管的尖端插入玻璃球内。待玻璃球冷却后，向外拉动原始微移液管，使其断裂，而将尖端保留在玻璃球内部。重复此操作，直至获得所需口径的尖端。
      注意：微移液管尖端内径示例：红细胞（RBC）为2.0–2.4 µm，微珠约为1.5 µm，T细胞为2–4 µm，杂交瘤细胞约为7 µm。
2. 构建细胞室
   注意：细胞室基于自制的腔室支架构建，该支架由两块金属方片（铜/铝）和连接它们的把手组成（图1D）。
3. 使用玻璃切割器将一块40 mm × 22 mm × 0.2 mm的盖玻片切割成两块40 mm × 11 mm × 0.2 mm的盖玻片（分别称为盖玻片1和盖玻片2）。用真空脂将盖玻片1粘附在腔室支架的顶部，使其横跨两块金属方片；同样地，将盖玻片2粘附在底部，从而形成一个平行盖玻片的细胞室（图1D）。
4. 使用移液器在两块盖玻片之间注入200 µl实验缓冲液。确保缓冲液与两块盖玻片均接触。轻轻旋转并晃动腔室，使缓冲液流至腔室两端。
5. 小心地将矿物油注入实验缓冲区两侧的腔室空间，以密封缓冲液，防止其暴露于空气中。分别在缓冲区的上部、中部和下部区域注入探针微珠（例如，pMHC包被的微珠）、红细胞（RBCs）和靶细胞（例如，T细胞）的悬浮液。

4. BFP 实验

1. 打开显微镜（材料清单）和光源。将样品室放置在显微镜主载物台上（图1A，D）。
2. 安装三根BFP微移液管（图1D。左侧：探针，用于抓取红细胞；右侧：靶标，用于抓取细胞或微珠；右下角：辅助管，用于抓取微珠）。
   1. 使用微注射仪（材料清单）将实验缓冲液从后端填充至微移液管中。取下移液管固定器（材料清单），将其置于较低位置，使液体从尖端滴出。迅速将微移液管插入固定器尖端，并确保插入过程中无气泡进入微移液管。拧紧固定器螺丝。
   2. 将每个移液管固定器安装到对应的微操作器上。推动微移液管使其尖端进入样品室内的缓冲液区域。调节微移液管的位置，并在显微镜视野中找到它们。
3. 移动样品室载物台，逐一寻找三种组分的聚集体（红细胞、靶标和探针微珠）。通过旋转操作器旋钮调节相应微移液管的位置，使移液管尖端接近某一细胞/微珠。通过调节对应微移液管内的压力，吸住该细胞/微珠。三根微移液管将分别捕获其对应的组分。
4. 移动样品室载物台，找到远离已注入组分聚集体的空旷区域，作为实验操作区域。切换显微镜观察模式，在计算机屏幕上通过程序显示图像。将三根移液管尖端上的组分均移入程序视野范围内。
5. 对齐探针微珠与红细胞，小心操控探针微珠至红细胞顶端，短暂撞击红细胞后轻柔回撤。调节辅助微移液管的压力，轻轻吹出微珠，使其粘附在红细胞顶端（图1F）。移开辅助微移液管，对齐靶标与探针微珠（图2A）。
6. 在程序中，于视野窗口内使用工具测量探针微移液管半径（Rp）、红细胞半径（R0）以及红细胞与探针微珠之间的圆形接触区域半径（Rc），从而可通过以下公式估算红细胞的弹簧常数（k），其中Δp为探针移液管尖端的吸吮压力。注：根据胡克定律，结合力F可通过弹簧常数与探针微珠位移（d）的乘积量化，即F = d（图2C）。
   
7. 在程序中输入所需的红细胞弹簧常数（请参见方案部分4.6。力钳实验和黏附频率实验通常设定为0.25或0.3 pN/nm，热涨落实验则设定为0.1 pN/nm），程序将返回以厘米水柱为单位所需的吸吮压力。调节连接探针移液管的水箱高度，直至达到所需吸吮压力。
8. 在红细胞顶端画一条水平线，相邻窗口将显示沿此线各像素的亮度（灰度值）曲线。将阈值线拖动至曲线深度约一半的位置（图2A，B）。
   注意：亮度曲线上位于阈值线下方的最低点表示微珠边界的位�置，因此仅允许存在一个局部最小值。若出现两个或更多局部最小值，则表明图像质量不理想（可能由于失焦，或探针微珠与红细胞未对齐所致）。
9. 选择所需的实验模式：热涨落实验、黏附频率实验或力钳实验。根据需要设置参数（例如，撞击力 = 15 pN，加载速率 = 1,000 pN/s，接触时间 = 1 秒，钳制力 = 20 pN（用于力钳实验）等）。
   1. 点击“开始”按钮，程序将驱动靶标移液管，使靶标与探针反复接触与分离（详见代表性结果部分）。数据采集将同步进行，实时记录探针微珠的位置。点击“停止实验”按钮结束程序，此时将弹出窗口以便保存所获取的数据。

结果

图1：fBFP组装示意图。

（A）fBFP硬件系统的整体示意图。（B）fBFP硬件系统的示意图。（C）双摄像头系统“DC2”（橙色），其上安装有高速相机（蓝色）和荧光相机（白色）。（D）显微镜载物台，可适配实验腔室及三个微管操纵系统。（E 和 F）实验腔室内BFP设置的显微图像。（E）微管组装结构，显示探针微管（左侧）、目标微管（右上方）和辅助微管（右下方）。（F）探针微珠的放置。通过辅助微管操控一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸二氢钠一水合物 (NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> &bull; H<sub>2</sub>O)	Sigma-Aldrich	S9638	磷酸盐缓冲液配制
无水磷酸氢二钠 (Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>)	Sigma-Aldrich	S7907	磷酸盐缓冲液配制
碳酸钠 (Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>)	Sigma-Aldrich	S2127	碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液配制
碳酸氢钠 (NaHCO<sub>3</sub>)	Sigma-Aldrich	S5761	碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液配制
氯化钠 (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	N2-5% 缓冲液配制
氯化钾 (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	N2-5% 缓冲液配制
磷酸二氢钾 (KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)	Sigma-Aldrich	P5655	N2-5% 缓冲液配制
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389	N2-5% 缓冲液配制
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	微珠功能化
生物素-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	红细胞生物素标记
制霉菌素	Sigma-Aldrich	N6261	红细胞渗透压调节
氢氧化铵 (NH<sub>4</sub>OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	玻璃微珠硅烷化
甲醇	BDH	67-56-1	玻璃微珠硅烷化
30% 过氧化氢 (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)	J. T. Barker	Jan-86	玻璃微珠硅烷化
冰醋酸	Sigma-Aldrich	ARK2183	玻璃微珠硅烷化
3-巯丙基三甲氧基硅烷 (MPTMS)	Uct Specialties, llc	4420-74-0	玻璃微珠功能化
硼硅酸盐玻璃微珠	Distrilab Particle Technology	9002	玻璃微珠功能化
链霉亲和素-马来酰亚胺	Sigma-Aldrich	S9415	玻璃微珠功能化
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	A0336	配体功能化
Fura2-AM	Life Technologies	F-1201	细胞内钙荧光染料负载
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	细胞内钙荧光染料负载
Quantibrite PE 微珠	BD Biosciences	340495	密度定量
毛细管 0.7-1.0 mm × 30 英寸	Kimble Chase	46485-1	微移液管制作
Flaming/Brown 微移液管拉制仪	sutter instrument	P-97	微移液管制作
Narishige	Narishige	Narishige	微移液管制作
矿物油	Fisher Scientific	BP2629-1	腔室组装
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-544-G	腔室组装
微注射器	World Precision Instruments	MF34G-5	腔室组装
1 ml 注射器	BD	309602	腔室组装
微移液管固定器	Narishige	HI-7	腔室组装
显微镜 (TiE 倒置)	Nikon	MEA53100	BFP 系统
物镜 CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	BFP 系统
相机，GE680，640 × 480，GigE，1/3" CCD，单色	Graftek Imaging	02-2020C	BFP 系统
Prosilica GC1290 - ICX445，1/3"，C 接口，1280 × 960，单色，CCD，12 位 ADC	Graftek Imaging	02-2185A	BFP 系统
带高分辨率远程控制的手动亚微米探头	Karl Suss	PH400	BFP 系统
防振台 (5&rsquo; × 3&rsquo;)	TMC	77049089	BFP 系统
三维手动平移台	Newport	462-XYZ-M
SolidWorks 3D CAD 软件	SolidWorks 3D CAD 软件	版本 2012 SP5	BFP 系统
LabVIEW 软件	National Instruments	版本 2009	BFP 系统，BFP 程序
三维压电平移台	Physik Instrumente	M-105.3P	BFP 系统
线性压电执行器	Physik Instrumente	P-753.1CD	BFP 系统
碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH 8.5)			8.4 g/L 碳酸钠 (Na2CO3)，10.6 g/L 碳酸氢钠 (NaHCO3)
N2-5% 缓冲液 (pH 7.2)			27.6 g/L 磷酸二氢钠 (NaH2PO4 &bull; H2O)，28.4 g/L 无水磷酸氢二钠 (Na2HPO4)
&nbsp; &nbsp;	&nbsp; &nbsp;	&nbsp; &nbsp;	20.77 g/L 氯化钾 (KCl)，2.38 g/L 氯化钠 (NaCl)，0.13 g/L 磷酸二氢钾 (KH2PO4)，0.71 g/L 无水磷酸氢二钠 (Na2HPO4)，9.70 g/L 蔗糖