竞争结合实验研究竞争性GTP酶结合蛋白伙伴

摘要

来源：Williamson, R. C.，等.  利用竞争实验比较GTP酶结合蛋白的亲和力。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了一种用于研究GTP酶结合蛋白伙伴的竞争性结合实验。通过将结合了核苷酸的GTP酶蛋白固定在磁珠上，可研究两种相互作用的蛋白伙伴对GTP酶同一结合位点的竞争性结合，从而评估这些蛋白伙伴的结合亲和力。

方案

1. GST标签GTP酶的纯化

1. 培养 E. coli 在500 ml自诱导培养基（25 mM Na）中，于37 °C、220 rpm振荡培养过夜，转化pGEX-Rac1的BL21菌株₂HPO₄，25 mM KH₂PO₄，50 mM NH₄Cl, 5 mM Na₂SO₄，2 mM MgSO₄₄，2 mM CaCl₂0.5% 甘油，0.05% 葡萄糖，0.2% 乳糖，5 g 胰蛋白胨，2.5 g 酵母提取物，100 µg/ml 氨苄青霉素
2. 在 4 °C 条件下，以 10,000 x g 离心 10 分钟收集细菌。
3. 将细菌沉淀重悬于20 ml蛋白提取试剂和1×蛋白酶抑制剂中，室温下颠倒孵育20分钟。
4. 4℃下以40,000 x g离心30分钟，澄清裂解液。
5. 加入2 ml谷胱甘肽磁珠，用磷酸盐缓冲液（PBS: 10 mM Na₂HPO₄，1.8 mM KH₂PO₄，137 mM NaCl，2.7 mM KCl。
6. 4 °C 条件下孵育 2 小时，期间倒置混匀。
7. 用磁性粒子分选仪在每步操作中沉淀蛋白负载的珠子，每次用10 ml PBS洗涤，共洗涤四次。
8. 将载有蛋白质的磁珠重悬于2 ml PBS中，分装为100 µl每份，于-80 °C保存备用。

2. GTP酶结合蛋白的表达

1. 实验前一天，将编码各GTP酶结合蛋白的绿色荧光蛋白（GFP）标记版本的质粒分别转染至多个75 cm²的HEK293T细胞培养瓶中，具体步骤如下。为验证核苷酸负载情况，需将GFP标记的TrioD1转染至第三个75 cm²的HEK293T培养瓶中。
   1. 将聚乙烯亚胺用100 µl无菌150 mM NaCl稀释至1 mg/ml。
   2. 取27 µl稀释后的聚乙烯亚胺加入223 µl低血清培养基中。
   3. 将12 µg质粒DNA加入250 µl低血清培养基中。
   4. 将各管在室温下孵育2分钟。
   5. 将聚乙烯亚胺溶液与DNA溶液混合于同一管中，涡旋振荡2分钟。
   6. 在室温下孵育15–20分钟。
   7. 将90%汇合度的HEK293T细胞中原有培养基（DMEM高糖培养基，含10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺，不含抗生素）更换为5 ml新鲜培养基。
   8. 将混合后的聚乙烯亚胺/DNA复合物加入培养瓶中，于37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。

3. GTP酶结合蛋白的纯化

1. 用 PBS 清洗转染细胞的培养瓶，并倒置 5 分钟，吸除多余液体。
2. 用 500 µl 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 7.8)，1% Nonidet P-40，1×蛋白酶抑制剂）刮取细胞至微量离心管中。
3. 在 4 °C 下颠倒混匀 30 分钟，使细胞裂解。
4. 裂解期间，将两份 40 µl 的 GFP-Trap 磁珠分别用新鲜裂解缓冲液洗涤三次，每次洗涤后在 2,700 × g 离心 2 分钟以沉淀磁珠。
5. 将裂解液在 21,000 × g 离心 10 分钟，以澄清裂解物。
6. 将每种竞争蛋白的澄清裂解液分别转移至已洗涤的 GFP-Trap 磁珠中，于 4 °C 颠倒混匀孵育 2 小时，使 GFP 融合蛋白结合；将来自 GFP-TrioD1 细胞的裂解液置于冰上保存。
7. 用 50 mM Tris-HCl (pH 7.8)、50 mM NaCl、0.7% (w/v) Nonidet P-40 洗涤载有蛋白的 GFP-Trap 磁珠两次，再用 50 mM Tris-HCl (pH 7.6)、20 mM MgCl₂ 洗涤两次，每次洗涤后均在 2,700 × g 离心 2 分钟以沉淀磁珠。
8. 加入 40 µl 0.2 M 甘氨酸（pH 2.5），上下吹打 30 秒以洗脱 GFP 融合蛋白；立即在 21,000 × g 离心 60 秒，将上清液转移至含有 4 µl 1 M Tris-HCl (pH 10.4) 的新微量离心管中。操作应迅速，以尽量减少对纯化蛋白的损伤。
9. 取每种纯化蛋白 1 µl 进行 Western 印迹分析，使用抗 GFP 抗体并依据制造商说明书采用定量印迹系统测定相对产量。或者可通过双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度，但如果蛋白对该检测的反应不一致或存在污染蛋白，则可能引入误差。
10. 通过添加 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 和 20 mM MgCl₂，调整各蛋白的摩尔浓度至相等。

4. GTP酶的核苷酸加载

1. 解冻一份在步骤1中制备的GST-Rac1磁珠。
2. 取90 µl GST-Rac1磁珠，用20 mM Tris-HCl（pH 7.6）、25 mM NaCl、0.1 mM DTT和4 mM EDTA缓冲液洗涤三次，每次洗涤均使用磁性粒子分选仪沉淀磁珠。
3. 吸除磁珠中的缓冲液，并加入100 µl 20 mM Tris-HCl（pH 7.6）、25 mM NaCl、0.1 mM DTT和4 mM EDTA缓冲液。
4. 根据竞争实验是否需要GDP、GTP或无核苷酸负载，向60 µl GST-Rac1磁珠中加入12 µl 100 mM GDP、12 µl 10 mM 鸟苷-5'-[γ-硫代]三磷酸（GTPγS）或不加任何核苷酸。
5. 对于核苷酸负载对照组，将剩余磁珠均分为三份，每份10 µl，并分别向每管中加入2 µl 100 mM GDP、2 µl 10 mM GTPγS或不加任何核苷酸。
6. 将磁珠混合物在30 °C下振荡孵育30分钟。
7. 通过加入1 M MgCl₂稳定结合核苷酸的Rac1：向实验组混合物（步骤4.4）中加入3 µl，向每个对照组混合物（步骤4.5）中加入0.5 µl。

5. 竞争性结合

1. 准备6个微量离心管，每管包含：
   200 µl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   10 µl 实验性核苷酸负载的Rac1珠粒（来自步骤4.7）
   5 µl Rac1结合蛋白A（恒定结合蛋白）
2. 向每个离心管中分别加入0、1、2.5、5、10或20 µl Rac1结合蛋白B（可变结合蛋白）。这些体积假设恒定与可变结合蛋白的储备浓度大致相等，必要时可根据实际情况进行调整。
   1. 如果两种蛋白的结合亲和力存在显著差异，应相应调整结合蛋白A和B的体积，具体应通过实验重复进行经验性确定。通过添加50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 和20 mM MgCl₂，将结合反应体系总体积补至235 µl。
3. 设置一个微量离心管，其中包含：
   200 µl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   10 µl 实验性核苷酸负载的Rac1珠粒（来自步骤4.7）
   10 µl Rac1结合蛋白A（恒定结合蛋白）
4. 设置GDP、GTPγS以及无核苷酸的对照管：
   200 µl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl₂
   10 µl 在步骤4.5中分别负载GDP、GTPγS或无核苷酸并在步骤4.7中稳定的对照Rac1珠粒
   180 µl 按步骤3.6制备的HEK293T GFP-TrioD1裂解液
   4 µl 1 M MgCl₂
5. 在4 °C条件下，将混合物颠倒混匀，孵育2小时。
6. 用50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 和20 mM MgCl₂ 溶液将珠粒洗涤三次。
7. 用20 µl还原性上样缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20%甘油, 0.02 mg/ml溴酚蓝, 5% β-巯基乙醇）洗脱结合的蛋白质。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETE蛋白酶抑制剂	Roche	05 056 489 001
谷胱甘肽磁珠	Pierce	88821
支化聚乙烯亚胺，平均分子量 ~ 25,000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Sigma Aldrich	D5796
胎牛血清	Life Technologies	10270-1-6
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	极不稳定。重悬后立即分装并保存于-80°C
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	极不稳定。重悬后立即分装并保存于-80°C
封闭缓冲液	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
抗GFP抗体	Living Colors	632592	使用时稀释1000倍
DyLight 800标记的山羊抗兔二抗	Fisher Scientific	10733944
Odyssey SA红外成像系统	Li-cor	9260-11PC