病毒抗原微阵列检测法用于检测血清中针对病毒抗原的抗体亚型

摘要

来源：Khan, S.，等，利用流感抗原微阵列测量血清抗体在不同病毒亚型间的广度。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了使用印有流感病毒株抗原亚型的微阵列芯片，对多个人类血清样本中的抗体亚型进行检测的过程。

方案

1. 制备流感抗原微阵列

1. 将抗原打印到微阵列载玻片上
   1. 将每种冻干抗原用含0.001% Tween-20的磷酸盐缓冲液（T-PBS）重悬至浓度为0.1 mg/mL。取每种重悬后的抗原各10 μL，分别加入未处理的384孔平底板的各个孔中。
   2. 使用微阵列打印机和低体积微阵列点样针进行抗原打印，点样针通过抽吸将抗原吸入样品通道并沉积 通过 通过直接接触和毛细作用转移到16-pad硝酸纤维素包被的玻片上。
      1. 使用打印软件（例如 Gridder）设置源板配置和打印参数。
         1. 使用下拉菜单选择将与此打印方法配合使用的板型名称。本研究中使用未处理的384孔平底板。
         2. 选择紧邻的文本框 培养皿数量 输入此打印方案中将使用的样本板数量。本研究中使用1块板。
         3. 选择与此方法配合使用的针脚配置。本研究中采用8针配置。
         4. 确保原点偏移量是载玻片原点（在管理部分已校准）与打印针在载玻片上开始打印位置之间的距离（X方向和Y方向）。
         5. 使用 阵列设计 标签，定义阵列的大小和形状（点间距以及每个子阵列中的点数）。本研究中，使用8根点样针，在16-pad载玻片上以18×18格式打印324个点（直径180 μm，间距300 μm）。
         6. 选择打印针吸取和分配样本的参数。本研究中，每根针吸取 250 nL 抗原溶液，并在每个点上打印 1 nL，共打印 40 个点（8 根针共打印 20 张载玻片）
         7. 设置针头清洗程序和吸液程序。本研究中，每个打印抗原的针头均需浸入无菌 ddH₂O 中₂在超声清洗容器中震荡，然后吸取下一个抗原。
         8. 定义样本块在载玻片上的打印顺序。阵列软件将构建一个带注释的网格索引（.gal）文件，以描述每个微阵列中抗原的排列方式。
            注意： 顶行用于放置基准标记物（在成像所用的所有波长下均具有荧光，例如本研究中使用 Qdot 585 nm 链霉亲和素偶联物与 Qdot 800 nm 链霉亲和素偶联物的混合物），以在成像过程中对网格进行定位。对于长时间的打印运行，可通过反复吹打并离心的方式，定期重新悬浮源板中的抗原；或者可制备并使用新的源板。
   3. 将未杂交的微阵列芯片置于避光盒中，并存放于室温下的干燥柜内长期保存。
      注意： 此时可无限期暂停该实验方案。
2. 进行质量控制检测（需要多聚组氨酸标签）
   1. 将切片连接至探针杂交室，并按照步骤 2.1.1-2.1.2 所述及图中所示，用封闭缓冲液重新水化 图1.
   2. 将小鼠单克隆 poly-His 抗体用滤过的 1× 封闭缓冲液按 1:100 比例稀释。
      注意： 如果使用非纯化蛋白抗原（例如，在...中表达的） 体外 转录和翻译系统）被直接用于打印微阵列，并添加蛋白质表达系统的组分（例如， E. coli 以1:10的比例将裂解液与用于血清稀释的封闭缓冲液混合，以封闭针对这些组分的任何抗体。
   3. 向每个含有芯片垫的玻片腔室中加入100 μL稀释后的抗多聚组氨酸抗体，吸除液体后，在室温下振荡孵育2小时，或在4 °C下振荡过夜。按照步骤2.2.1所述，用T-TBS缓冲液洗涤3次。将生物素标记的山羊抗小鼠IgG二抗用封闭缓冲液按1:200稀释，吸除液体后每孔加入100 μL，室温振荡孵育1小时。用T-TBS缓冲液洗涤3次。
   4. 将Qdot 585 nm链霉亲和素偶联物用封闭缓冲液稀释至4 nM，每孔加入100 μL，吸除液体后在摇床上室温孵育1小时。用T-TBS缓冲液洗涤3次，再用不含Tween的TBS缓冲液洗涤1次。
   5. 按照步骤 2.2.5 – 3.1.2 中所述方法拆解并定量载玻片。
      注意： 蛋白质抗原必须含有His10标签才能使用本质量控制方案。或者，如果含有其他类型的标签，则可使用针对该标签的抗体或配体进行质量控制检测。

2. 使用微阵列检测血清中的流感抗体

1. 在微阵列上孵育血清以进行抗体结合。
   1. 使用夹子将微阵列玻片固定到孵育腔室中，并按 图2 所示将其放入框架内。
      注意：操作过程中应始终避免用手或器械接触微阵列垫面。确保玻片方向正确，垫面朝上，且右上角的小缺口位于正确位置。
   2. 每孔加入100 μL过滤后的1×封闭缓冲液对微阵列玻片进行再水化，并在100 μL封闭缓冲液中将血清稀释1:100（可使用未处理的96孔板或2 mL离心管）。将再水化的微阵列玻片和稀释后的血清分别置于加盖的框架中，在室温下以100–250 rpm的转速于旋转摇床上孵育30分钟。后续所有孵育步骤均以相同条件在摇床上进行。
      注意：血清应分装后于-80 °C冷冻保存，以长期储存并尽量减少冻融循环次数；使用前需涡旋混匀，并离心去除颗粒物。在此步骤期间及之后应仔细观察玻片腔室，及时发现可能导致漏液的问题并重新组装腔室。
   3. 使用连接真空管线并配有二级收集瓶的移液器吸头，小心地从每个腔室的角落吸除封闭缓冲液，注意不要触碰垫面。后续所有吸除步骤均以此法操作。吸除缓冲液后应迅速向垫面上加入稀释的血清，防止垫面干燥。
   4. 将加盖的框架放入托盘中，并置于带有湿润纸巾的次级容器内，密封以防止蒸发。在4 °C条件下于摇床中过夜孵育（也可选择在室温下以100–250 rpm的转速于旋转摇床上孵育2小时）。
2. 使用量子点标记的二抗对结合的血清抗体进行标记
   1. 如上所述小心吸除腔室中的血清，每孔加入100 μL T-TBS缓冲液（20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.05% Tween-20溶于ddH₂O中，调pH至7.5后过滤；可购买商用产品），在100–250 rpm的旋转摇床上孵育5分钟。重复该洗涤步骤共3次（后续所有洗涤步骤均以此法进行）。
   2. 将二抗用封闭缓冲液稀释至1 μM，配制成混合液，并在使用前及使用过程中通过反复移液充分混匀，以保持溶液均一性。
      注意：为保证实验的可重复性，所有需进行跨实验数据定量比较的检测实验应使用同一批次的每种二抗。二抗的具体浓度可能需根据其亲和力进行调整；若有说明，应遵循生产商提供的操作指南。
   3. 最后一次洗涤后吸除缓冲液，每孔加入100 μL二抗混合液，在室温下于摇床上孵育2小时。
   4. 吸除二抗混合液，用T-TBS缓冲液洗涤3次，再用TBS缓冲液（不含Tween）洗涤1次。
   5. 小心拆卸微阵列玻片与腔室的连接，避免接触垫面，用过滤的ddH₂O轻轻冲洗，然后将玻片放入50 mL离心管中，在500 × g离心10分钟以干燥。
   6. 将完成检测的微阵列玻片放入避光盒中，长期储存时置于室温下的干燥柜中。
      注意：本实验方案可在该步骤处暂停，最长可暂停1周。

3. 在微阵列中定量抗体与抗原的结合

1. 通过可视化芯片载片并量化点阵荧光强度，以测量抗体结合情况。
   1. 使用内置软件的便携式成像仪获取芯片载片的图像。
      1. 在 Configure Imager 选项卡中，选择正确的载片配置。本研究中使用16-pad载片。
      2. 在 Image Control 选项卡中，选择合适的荧光通道，并根据血清反应性调整增益、曝光时间和采集时间，以获得最佳图像。本研究中，IgA和IgG的荧光通道分别为585 nm和800 nm，成像参数设置为增益50、曝光时间500 ms、采集时间1 s。
      3. 点击Capture开始图像采集过程。
         注意：只要将芯片载片保存在避光干燥环境中，即可在多种设置下重复成像而不导致信号衰减。若其他成像系统与载片兼容，也可使用。
2. 基于定位标记（fiducial markers）的方向使用网格识别芯片点阵，并以点阵周围背景校正后的像素强度中位数来测量点阵强度。使用内置成像仪软件批量执行该量化算法，该软件利用步骤1.1.2中构建的.gal文件将点阵强度与每个芯片上的各个抗原相对应。
   1. 在 File Info 面板中，通过从计算机文件夹中选择上传.gal文件，并在 Analysis Options 部分指定分析输出文件的保存文件夹。
   2. 在 Image Control 选项卡中，打开一张待量化的已获取图像，并点击右上角的 Auto 按钮。
   3. 在右下角的 Array Analysis 区域，根据软件提示创建定位模板。
   4. 点击 Batch Analysis，选择包含待量化图像的文件夹，并选择上一步创建的定位模板。软件将逐个分析图像并量化点阵强度。
      注意：此步骤将生成一个.csv文件，其中包含量化每个血清样本中抗体结合至芯片上各抗原的点阵强度数据，后续可在电子表格处理或分析软件中进行操作。
3. 分析原始数据，比较不同抗原之间及不同血清样本之间的抗体结合情况。本研究中，在不同日期使用不同载片进行的两次独立实验运行中，比较了以585 nm和800 nm荧光点阵强度测量的IgA和IgG抗体，并进行了相关性分析以评估检测的可重复性。
   注意：对于以表达混合物形式打印的非纯化蛋白，数据分析应首先对无DNA对照进行背景扣除。

结果

图 1： 流感抗原微阵列打印与探查流程示意图。 从左至右依次为：在硝酸纤维素包被的载玻片上进行微阵列打印，利用量子点标记的二抗对血清中的 IgG 和 IgA 抗体进行探查，使用便携式成像仪对载玻片进行成像，并对结果进行分析以生成热图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16孔硝酸纤维素包被玻片	Grace Bio Labs	305016
1× GVS FAST 封闭缓冲液	Fischer Scientific	10485356
ArrayCam 便携式成像仪	Grace Bio Labs	400S	若其他成像设备能够达到微阵列斑点的分辨率，并兼容量子点的激发和发射波长，也可用于玻片的可视化。
生物素标记的山羊抗小鼠IgG抗体	Thermo Fischer	31800
HiBase 384孔板	Greiner Bio-One	T-3037-11
微阵列点样针	ArrayIt	GMP2	不同型号的微阵列打印机可能需要配套的专用点样针。
小鼠单克隆多组氨酸抗体	Sigma-Aldrich	H1029
OmniGrid 100 微阵列打印机	GeneMachines		本研究中使用的微阵列打印机型号目前已不再商业化供应，但Digilab（美国马萨诸塞州霍普金顿）生产的更新型号OmniGrid Accent微阵列打印机功能类似，且大多数市售微阵列打印机均可采用相同实验方案。
ProPlate 玻片孵育室	Grace Bio Labs	246890
ProPlate 玻片夹	Grace Bio Labs	204838
ProPlate 玻片框架	Grace Bio Labs	246879
585 nm量子点标记的山羊抗人IgA抗体	Grace Bio Labs	110620
585 nm量子点标记的链霉亲和素偶联物	Thermo Fischer	Q10111MP
800 nm量子点标记的山羊抗人IgG抗体	Grace Bio Labs	110610