用于发育研究的鸡胚开窗法

摘要

胚胎易于获取的特点使得研究人员能够采用多种方法进行细胞命运图谱的绘制实验，包括鸡-鹌鹑嵌合体和局灶性染料标记等技术。本文中，我们展示了一种已优化用于延长存活时间的卵子制备方法。

摘要

发育研究得益于鸡胚作为实验模型的广泛应用。鸡胚易于接触的特性使得研究人员能够采用多种方法标记细胞命运，包括鸡-鹌鹑嵌合体和局灶性染料标记技术。此外，该模型还适用于多种分子干预手段，如蛋白包被珠的植入以及通过胚内电穿孔导入质粒DNA。这些实验为中枢和外周神经系统的发育研究提供了重要数据。在许多此类研究中，必须打开蛋壳并在不干扰胚胎发育的情况下重新封闭。通过再次打开蛋壳，可对胚胎在连续发育阶段进行观察。尽管已有多种优秀的鸡胚蛋壳打开方法，本文介绍的是一种经过优化、可实现较长存活时间的方法。该方法中，将鸡蛋侧放，在蛋壳上切开一个小窗口。实验操作完成后，将原蛋壳复位并覆盖蛋窗，在其上覆盖透明塑料胶带，以保护胚胎并帮助维持孵化剩余期间的湿度。该方法自孵化两天起开始使用，已成功实现胚胎至成熟阶段的存活。

方案

1. 从培养箱中取出卵

1. 在相对湿度高于60%的条件下，保持37°C培养。
2. 取出鸡蛋；将鸡蛋旋转90°，使较大的底部呈水平放置。

2. 擦拭鸡蛋以灭菌

1. 用70%乙醇浸透一叠非无菌纱布。
2. 使用两到三片纱布擦拭最多5个卵。纱布污染后即弃用。

3. 准备去除蛋白的位点

1. 剪取一片 1 英寸 × 1 英寸的 3M 塑料胶带，置于基座左侧，以保护白蛋白被抽出的区域。

4. 去除蛋白

1. 用剪刀尖在胶带中央刺一个小孔。
2. 使用带有18号、1英寸针头的10 cc注射器，缓慢将针头穿过剪刀所刺的小孔。
3. 以45°C角度将针头向下刺向蛋的底部。
4. 将针头向中心倾斜，抽取3至4 mL的蛋清。

5. 窗宽调节

1. 裁剪一块 3 英寸 × 3 英寸的塑料胶带，将其拉伸后覆盖在鸡蛋顶部。将正方形胶带的四个角沿鸡蛋水平面的弧形末端延展，注意不要过度拉扯。使胶带紧贴鸡蛋表面，确保无褶皱。
2. 使用一把锋利的 4 英寸直头解剖剪，在胶带覆盖区域底部中心处扭转出一个孔。缓慢将剪刀的下刃插入鸡蛋，确保剪刀尖端始终紧贴蛋壳内壁。将刀刃朝向底部方向，缓慢开始切割蛋壳。按逆时针方向进行，至接近顶部中心时停止。取出剪刀，反向重复操作，直至仅剩少量蛋壳相连。检查确认鸡蛋已受精。关闭窗口。

6. 封闭、重新打开并密封卵壳。

1. 取一段长约5-8厘米、宽约1.3厘米的塑料胶带，将其贴回原先切开的孔洞处，确保封口严密。另取一块1×1英寸的胶带，封住用于抽取蛋液的孔洞。使用镊子重新打开蛋壳以进行所需操作。当准备将蛋放回孵育箱时，剪下一块足够大的胶带，将其完全覆盖在窗口处，并密封整个蛋的水平表面。

讨论

该方法可在实验操作后实现较长的胚胎存活时间。例如，染料标记研究中，胚胎可在命运图谱研究中存活至E10或更晚阶段（1）。此外，该技术已用于鸡胚内电穿孔研究，通过调节基因表达水平，并使胚胎发育持续至后续发育阶段（2-6）。这种开窗技术可与任何需要胚胎操作后继续存活的实验程序联合使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
旋转培养箱		Profi		维持在 37° 摄氏度，相对湿度保持在 60% 以上
70% 乙醇
纱布
3M 塑料胶带
10 毫升注射器				每枚鸡蛋使用 1 个
18G 针头				1½ 英寸针头，每支注射器配 1 个
解剖剪刀				4" 锋利直刃
受精卵