无菌实验技术：平板接种方法

摘要

在使用用于培养微生物的培养基和试剂时，必须采用无菌技术，以确保将污染降至最低。多种平板接种方法被常规用于分离、扩增或计数细菌和噬菌体，这些方法均包含维持实验材料无菌状态的操作步骤。

摘要

所有无生命物体的表面均存在微生物，这些微生物构成了实验室中普遍存在的潜在污染源。实验的成功取决于科研人员对工作台面和设备进行灭菌的能力，以及防止无菌仪器和溶液接触非无菌表面的能力。本文介绍了实验室中常规用于分离、扩增或计数细菌和噬菌体等微生物的几种平板接种方法的操作步骤。这五种方法均包含无菌技术，即保持实验材料无菌状态的操作程序。所描述的程序包括：（1）通过划线接种法分离细菌培养物以获得单菌落；（2）倾注平板法和（3）涂布平板法用于计数可存活的细菌菌落；（4）软琼脂覆盖法用于分离噬菌体并计数噬菌斑；（5）影印平板法用于将细胞以相同的空间模式从一个平板转移到另一个平板。这些操作可在实验台进行，前提是所涉及的微生物为非致病性菌株（生物安全等级1级，BSL-1）。若操作BSL-2级别的生物体，则必须在生物安全柜内进行。请查阅最新版的《微生物和生物医学实验室生物安全》（Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories，BMBL）以及《感染性物质材料安全数据表》（Material Safety Data Sheets，MSDS），以确定特定微生物的生物危害分类及其所需的防护措施和 containment 设施。细菌菌株和噬菌体原种可从科研人员、公司以及特定组织（如美国模式培养物集存库 American Type Culture Collection，ATCC）维护的保藏中心获得。建议在学习各种平板接种方法时使用非致病性菌株。通过遵循本实验方案中描述的步骤，学生应能够：

● 在不污染培养基的情况下完成平板接种操作。
● 通过划线接种法分离出单个细菌菌落。
● 使用倾注平板法和涂布平板法测定细菌的浓度。
● 在处理噬菌体时进行软琼脂覆盖操作。
● 利用影印平板法将细菌细胞从一个平板转移到另一个平板。
● 根据给定的实验任务，选择合适的平板接种方法。

方案

1. 准备安全且无菌的工作环境

1. 熟悉在处理微生物时应遵守的所有实验室规则和安全预防措施。无论生物危害等级如何，所有接触过微生物的材料均被视为感染性废弃物，在丢弃前必须进行去污处理。应遵循机构环境健康与安全部门提供的安全指南，设置适当的废弃物容器，以便立即并妥善处置可能被污染的材料（生物危害物）。
2. 在用于涂布操作前，应对所有仪器、溶液和培养基进行灭菌处理。
3. 清理实验台工作区域上所有杂乱的物品。
4. 使用消毒剂清洁工作区域，以尽量减少可能的污染。
5. 点燃本生灯，并在火焰上升气流所形成的无菌区域范围内缓慢、小心且有条不紊地操作。
   • 若操作的是生物安全二级（BSL-2）级别的微生物，应在生物安全柜内设置工作区。由于火焰产生的热量会干扰维持柜体功能所需的关键气流，因此不得在安全柜内使用本生灯。
6. 将实验所需的所有用品放置在靠近无菌区域的实验台上。确保所有材料均已正确标记。合理组织工作区域，以最大限度提高工作效率并避免不必要的移动，从而减少实验材料暴露于空气污染物的时间。
   • 将本生灯放置在实验台右侧。
   • 将琼脂平板或培养皿放置在左侧。
   • 将细胞培养物、试管、烧瓶和瓶子置于实验台中央。
   • 预先松动试管、烧瓶和瓶子的盖子，以便在后续操作中能单手轻松打开。
7. 在处理微生物之前，用抗菌皂和温水彻底洗手。

2. 划线平板操作：使用四区法分离细菌菌落

划线平板法旨在通过简单的机械分离，从混合菌群中分离出纯的细菌培养物，即菌落。单个菌落由数百万个细胞组成，这些细胞在琼脂平板表面或内部成簇生长（图1）。与单个细胞不同，菌落肉眼可见。理论上，一个菌落中的所有细胞均来源于最初接种到平板上的一个细菌，因此被称为克隆体，即遗传上完全相同的细胞簇。

• 细菌具有多种形态和大小。例如，单个 大肠杆菌 细胞呈杆状，平均长度为 2 μm 和宽度 0.5 μm 而 链球菌 细胞呈球形，平均直径为 1 μm某些细菌（例如 E. coli以单细胞形式存在，而另一些则形成特定的关联模式。 链球菌，例如，成对生长，或形成细胞链或细胞簇。通常认为单个菌落是由单个细胞经二分裂产生；然而，对于那些天然以成对、链状或簇状形式存在，或通过其他机制分裂的细菌而言，这一假设并不成立。此外，若涂布的细菌数量过多，则可能导致细胞重叠，增加两个或多个细菌共同形成一个看似单一菌落的概率。为避免在描述或计数固体培养基上生长的细菌培养物时出现上述问题，菌落通常被称为 菌落形成单位（cfu）.

通过划线分离法，将细胞混合物在培养皿中半固体琼脂培养基表面进行涂布，使细菌细胞逐渐减少并分散沉积在培养基表面相隔较远的位置，经培养后形成单个菌落。本文将介绍从细胞混合物中分离单菌落的四区划线法。

1. 划线接种可使用多种不同的工具完成（图2）。金属接种环可重复使用多次，常用于常规实验室菌株的划线接种。一次性塑料接种环可从商业途径获得，在生物安全柜中操作生物安全等级2级（BSL-2）菌株时更常使用。许多科研人员更倾向于使用一次性预灭菌的木棒或扁头牙签进行划线接种。这些工具成本低廉，是替代一次性塑料接种环的良好选择，尤其适用于处理可能含有产孢细菌的环境样品（如土壤）。
   • 一次性预灭菌的木棒和牙签无需在本生灯上灼烧，从而避免了产孢细菌不必要的气溶胶化，以及孢子对实验台面或琼脂平板的交叉污染。
2. 在琼脂平板底部边缘（而非盖子上）标记至少包括您的姓名、日期、培养基类型以及待接种微生物种类的信息。
   • 平板必须完全干燥，盖子上无冷凝水，并在划线接种前预热至室温。若平板储存于4 °C，应提前数小时甚至前一天取出。将平板分散放置，以不超过2-3个为一组交错堆叠，使其自然干燥。
3. 用于划线接种的样品可以是液体培养基中的细胞悬液，也可以是来自另一琼脂平板上的已有菌落。开始时，建议每次仅使用一个样品接种一个平板。为节省时间和材料，可在同一平板上接种多个样品，但应在熟练掌握单一样品划线技术后进行。
4. 对于第一象限，用快速、平稳的来回动作将样品取样后涂布于培养基表面约四分之一区域（图3的A图）。将倒置平板的底部从实验台抬起，使接种环、木棒或牙签在平板边缘至中心之间多次来回移动。
   • 若接种物为细胞悬液，使用金属接种环取一环菌液，或使用微量移液器取5至10 μl。取样前务必充分混匀或涡旋细胞悬液。操作过程中应遵循无菌技术，不仅灼烧接种环，还需在取样前后灼烧瓶口或试管口。同时，避免接种环或移液器枪头接触试管或瓶子内壁。若使用移液器加样，应先将细胞悬液滴加至平板适当位置，再用接种环、木棒或牙签将其涂布至第一象限。
   • 若接种物为另一平板上的菌落，应先轻轻接触菌落，再将其涂布至第一象限。使用金属接种环时，务必确保其已冷却后再接触菌落。为确认接种环温度适宜，可先轻触平板上不用于划线的区域。仅需取少量细胞，无需取整个菌落。
   • 若使用金属接种环，在取新接种物前需用本生灯灼烧灭菌（图3的B图）。从距离接种环约3-4英寸处开始，将金属丝置于火焰蓝色锥体尖端（最热区域），使其烧至红热。移动金属丝时，使火焰由远及近接近接种环。此操作可防止前次使用后残留在环上的细菌形成气溶胶。
   • 灼烧可杀死细菌（但不能杀灭孢子），同时热空气产生的对流可防止空气中的其他污染物在后续操作中沉降到金属丝上。
   • 若使用无菌扁头牙签，应以拇指和无名指轻轻夹住其窄端，与培养基呈10至20°角，用宽端进行划线。若使用接种环或木棒，应像握笔一样以相同角度持握。划线时力度不宜过大，避免接种环、木棒或牙签刺入琼脂。
5. 完成第一象限后，将平板倒置并放回实验台。丢弃木棒或牙签，或按步骤#4所述重新灼烧金属接种环。
6. 将培养皿旋转90°，开始划第二象限。将倒置平板的底部从实验台抬起，将接种环、木棒或牙签轻触第一象限末尾处的划线区域。采用来回划线方式，穿过第一象限后半段的划线，然后进入空白的第二象限。完成第二象限后，将平板倒置放回实验台。
   • 接种环、木棒或牙签不得再次进入第一象限前半段，即原始接种物主要分布的区域。
   • 每个象限应使用新的塑料接种环、木棒或牙签。
7. 重复步骤#6两次，依次完成第三和第四象限。
   • 务必在每个象限之间丢弃木棒或牙签，或重新灼烧金属接种环。
   • 划第四象限时应避免进入第一象限区域。
8. 将平板倒置培养，以防止冷凝水积聚在盖子上并滴落到菌落表面。

3. 倾注平板法：混合样品中细菌细胞的计数

该方法常用于计数混合样品中的微生物数量，即将样品加入到尚未凝固的熔融琼脂培养基中。当样品稀释度适当时，培养后可在固体培养基内部及表面形成均匀分布的菌落。该技术用于活菌平板计数，即统计单个平板上琼脂内部及琼脂表面的菌落形成单位总数。活菌平板计数为科研人员提供了标准化的方法，可用于绘制生长曲线、计算样品所来源试管中的细胞浓度，以及研究不同环境或生长条件对细菌细胞存活率或生长速率的影响。

1. 在无菌但空的培养皿底部边缘（非皿盖）标记至少包含您的姓名、日期、培养基类型以及将要接种到熔融琼脂培养基中的生物体类型的信息。
   • 如果进行连续稀释（即一系列重复稀释），导致样品中细胞浓度系统性降低，则需注明稀释倍数。当样品中细胞数量超过琼脂平板的承载能力时，必须制备连续稀释液，统计学上有意义的菌落数范围为30至300 cfu。若平板上菌落数超过300 cfu，则菌落会过于密集并相互重叠。
2. 取一支含有18 ml熔融琼脂培养基的试管。
   • 琼脂培养基应分装至试管中，并在高压灭菌器中预先灭菌。实验当天，将琼脂在蒸锅中加热融化30分钟，然后转移至55 °C水浴中。仅融化实验所需量的琼脂，因其不可重复使用。
   • 倾注平板前10分钟，将熔融琼脂试管从55 °C水浴转移至实验台上的加热块中，温度设定为48 °C。待琼脂温度达到此值后即可开始倾注。若琼脂温度过高，可能导致样品中的细菌死亡；若温度过低，凝固后的培养基可能出现结块。
3. 获取您的样品，样品应为液体培养物，或通过将菌落中的细胞混入缓冲液或生理盐水中制备的细胞悬液。
   • 样品可来源于单一原始样品的系列稀释液。
   • 接种的样品体积应在0.1至1.0 ml之间。
4. 打开空培养皿的皿盖，将样品滴加至培养皿中央（图4的A图）。关闭皿盖。
   • 整个操作过程应采用无菌技术。
   • 使用刻度吸管或微量移液器将样品转移至平板中。控制样品流速，避免溅出。
5. 取下熔融琼脂试管的管帽，并将开口试管的管口通过本生灯火焰灼烧。
6. 打开含有样品的培养皿皿盖，小心倒入琼脂（图4的B图）。关闭皿盖后，轻轻旋转培养皿以使样品与琼脂充分混匀。
7. 待琼脂完全凝固后，将平板倒置进行培养。

4. 涂布平板法：用于平板计数、富集、筛选或检测的单个细菌菌落形成

该技术通常用于分离存在于少量样品体积中的微生物，将样品涂布于琼脂平板表面，当细胞浓度适当时，可在琼脂表面形成均匀分布的独立菌落。除了用于活菌平板计数（即对单个平板上形成的菌落形成单位总数进行计数，并据此计算样品来源试管中细胞的浓度）外，涂布平板法还常规应用于富集、筛选和筛选实验中。这三种实验所期望的结果通常与平板计数相同，即在琼脂表面形成分散的独立菌落。然而，其目的并非确保所有活细胞均形成菌落，而是仅使群体中具有特定基因型的细胞得以生长。在需要对菌落进行后续分析的计数实验中，相较于倾注平板法，更常采用涂布平板法，因为涂布法的菌落生长于琼脂表面，易于获取，而倾注平板法的菌落则会嵌入琼脂内部。

本文描述了两种涂布平板的方法。第一种（方法A）使用旋转平台和形状类似曲棍球棒的玻璃或金属棒。第二种（方法B），称为“Copacabana法”，通过振荡预先灭菌的玻璃珠实现。两种方法均可促进细胞在琼脂表面均匀分布。

方法 A：使用旋转平台和玻璃或金属涂布棒进行涂布平板

1. 在琼脂平板底部边缘（非盖子）标记您的姓名、日期、培养基类型以及将要接种的生物体类型。
   • 若进行连续稀释接种，需注明稀释倍数。
   • 平板必须完全干燥，盖子上无冷凝水，并在涂布前预热至室温。若平板储存于 4 °C，应提前数小时甚至前一天取出。将平板以每堆不超过 2–3 个的方式分散放置，呈交错堆叠，使其自然干燥。
2. 将平板置于旋转盘中央（图 5）。
3. 获取待接种样品，样品应为液体培养物，或由菌落中的细胞混入缓冲液或生理盐水制成的细胞悬液。
   • 样品可来源于同一原始样品的系列稀释液。
   • 接种样品体积应在 0.1 至 0.2 ml 之间。
4. 打开培养皿盖子，将样品滴加至琼脂表面中央，随后盖上盖子。
   • 整个操作过程须采用无菌技术。
   • 使用微量移液器将样品转移至平板。控制液体流速，避免溅出。
5. 将玻璃棒或金属棒（又称涂布棒）浸入盛有 70% (v/v) 乙醇的烧杯中。
   • 警告：切勿将高温的涂布棒直接浸入乙醇中。
   • 乙醇仅应接触涂布棒底部及杆部最前端约 2.5 cm 的部分。
6. 通过在本生灯火焰上灼烧，使多余的乙醇滴落并点燃。
   • 火焰应沿接触过乙醇的涂布棒及杆部区域迅速燃烧后熄灭。
   • 若乙醇烧杯起火，切勿惊慌！立即用玻璃盖盖住烧杯，火焰将迅速熄灭。
7. 打开琼脂平板盖子，用左手拇指和食指握住盖子。将涂布棒在靠近平板边缘的琼脂表面轻轻触碰以冷却。
   • 切勿触碰已接种细胞的区域，高温涂布棒会杀死细胞。
8. 左手保持持握平板盖的同时，缓慢旋转转盘。
   • 尽管应尽量避免，若必须将盖子放下，应将其内表面朝下放置于本生灯无菌区域内的已消毒表面上。若盖子朝上放置，则因物体或手部移动产生的气流更易导致微生物和灰尘颗粒沉降到盖子内表面，增加污染风险。
9. 右手轻持涂布棒接触琼脂表面，随着转盘旋转，前后移动涂布棒，逐步将样品均匀涂布至整个平板表面。
10. 接种完成后，将平板正置静置至少 5 分钟，待样品充分吸收后，再倒置进行培养。

方法 B：使用玻璃珠涂布平板法：“Copacabana 方法”

1. 在琼脂平板底部边缘（非盖子）标记至少包含您的姓名、日期、培养基类型以及将要接种于该培养基上的生物体类型的标签。
   • 若进行涂板，需注明稀释倍数 连续稀释
2. 打开培养皿盖，用左手拇指和食指握住皿盖。随后打开装有预先灭菌玻璃珠的玻璃管或瓶子。用右手将管口或瓶口在火焰上灼烧灭菌，然后小心地将10–12颗无菌玻璃珠均匀分散至培养皿的琼脂表面图6). 盖上培养板的盖子，在重新盖上管或瓶的盖子之前，再次灼烧其瓶口边缘，然后将其放置一旁。
   • 将珠子从试管或瓶子中轻轻倒在琼脂上方几厘米处，以免珠子弹出培养皿。
   • 使用直径为 4 mm 的玻璃珠。将它们置于玻璃瓶或试管中，在高压灭菌器中进行灭菌 121 °C 在干燥循环（重力设置）下运行30分钟。
   • 使用珠子代替涂布棒的一个优点是无需为反复灼烧而准备盛有乙醇的敞口容器。
3. 打开培养皿盖，将样品接种于琼脂表面中央，盖上皿盖。
   • 在整个操作过程中使用无菌技术。
   • 分装100至 150 μl 每块平板加入适量样品，该体积有助于细胞均匀分布。使用微量移液器将样品转移至平板中，控制样品流速，避免溅出平板。
4. 轻轻晃动珠子，在琼脂表面来回晃动6到7次以铺展样品。为确保细胞均匀分散，应使用水平晃动方式。
   • 不要晃动磁珠，否则所有细胞都会聚集到培养板边缘。
   • 提示：若操作正确，该过程会发出类似“摇动沙锤”的声音。
5. 旋转培养板 60° 然后水平振荡6至7次。
6. 旋转培养板 60° 再次水平振荡。此时，应能使细胞在琼脂表面均匀分散。
7. 完成涂布后，样品应已被吸收，且琼脂表面应干燥。将受污染的玻璃珠倒入标有标签、盛有10%次氯酸钠溶液的收集烧杯中。
   • 切勿将珠子丢弃至垃圾桶！使用过的珠子将经过冲洗和高压灭菌处理，以重新灭菌并重复使用。
   • 注意：如果振荡三次后琼脂表面仍然湿润，请将平板静置数分钟，使液体被琼脂吸收，然后重复步骤 #4–6，直至平板表面看起来干燥。
8. 倒置平板进行培养。

5. 软琼脂覆盖法：噬菌体的斑块形成及分离与计数（噬菌斑测定法）

该技术常用于检测和定量大小在100至200 nm之间的噬菌体（即细菌病毒）。观察单个噬菌体颗粒需要使用电子显微镜。然而，感染性噬菌体颗粒的存在可通过琼脂平板上的噬菌斑进行检测（图7A）。噬菌体无法在其宿主细菌细胞外复制，因此扩增和检测时需在涂板前将噬菌体与宿主细胞混合。在软琼脂覆盖法中，取少量噬菌体悬液（通常为50 μl至200 μl），加入含有约10⁸个细菌（宿主细胞）的试管中，这些细菌均匀分散于2.5–3.0 ml的软质（0.5至0.7% [w/v]）熔融营养琼脂中。将所得混合物倾注于硬质（1.5至1.9% [w/v]）营养琼脂平板表面，轻轻晃动平板以确保软琼脂均匀覆盖整个硬琼脂表面。随后将平板置于水平面上，待上层琼脂完全凝固后，即可放入培养箱中培养。

随着时间推移，细菌细胞会形成浑浊的悬浮液，称为菌苔，在软琼脂培养基中清晰可见（图7B）。当噬菌体感染其中一个细菌细胞后，在细胞内复制并裂解该细胞，释放多达100个子代噬菌体（即爆发量），便会形成噬菌斑。新产生的噬菌体颗粒扩散至软琼脂中，感染裂解细胞周围区域的细菌。经过多轮感染与裂解循环后，软琼脂中的浑浊细菌悬浮液逐渐消失，留下透明区域，称为噬菌斑。每个噬菌斑含有超过10⁹个噬菌体颗粒，其基因组均与最初的感染性噬菌体颗粒完全相同。由于每个噬菌斑均由单个噬菌体颗粒引发，因此可通过计数形成的噬菌斑形成单位（pfu），计算出原始噬菌体悬液的浓度，即滴度。这种实验称为噬菌斑测定法，还可为科研人员提供标准化手段，用于绘制一步生长曲线、研究宿主范围特异性，以及在遗传学实验中实现细菌细胞的转导。

1. 准备指示菌： 需要制备处于对数生长期的宿主菌培养物，用于软琼脂覆盖实验。每种宿主菌都有其特定的生长条件。每个平板需要 0.3 ml 至 0.5 ml 的指示菌悬液。如果制备了较大体积的指示菌培养液（例如 25 ml），应将其分装成较小的等份（例如，将 5 ml 分装至无菌螺口管中），以尽量减少交叉污染的可能性。分装后的菌液可在冰上（4 °C）保存，直至实验使用。采用无菌操作技术接种无菌营养肉汤，并根据细菌菌株的具体要求进行培养。实验结束后剩余的培养物应丢弃。
2. 准备吸附管： 将两支无菌微量离心管放入离心管架中。将第一支管的管盖标记为“Phage”，第二支管的管盖标记为“Control”。
   • 通常需要制备噬菌体裂解液的连续稀释液并进行涂布，此时应在管架中增加额外的微量离心管，并标记相应的稀释倍数。
   • 噬菌体储备液应从单个噬菌斑新鲜制备，并在 4 °C 下保存。为使噬菌体颗粒充分分散，在实验前应将其恢复至室温。
   • 处理噬菌体储备液时应轻柔操作——禁止涡旋振荡或剧烈吹打。
3. 向第一支管中加入 50 μl 噬菌体样品，向第二支管中加入 50 μl 噬菌体缓冲液，后者作为噬菌斑测定的阴性对照。
   • 在整个噬菌体和细菌操作过程中均应采用无菌操作技术。
4. 随后向每支吸附管中加入 500 μl 指示菌。
   • 若指示菌悬液长时间置于冰上或实验台面上，细菌细胞会沉降到管底。若在取样前未充分混匀培养物，则转移至吸附管中的细菌细胞数量将不足。为确保在软琼脂中形成足够数量的细菌菌落（即形成菌苔），以便检测噬菌斑，应在将菌液转移至吸附管前，使用涡旋混合器轻轻重悬指示菌，使其成为均匀的悬液。
5. 通过轻轻弹击管壁的方式混匀细菌细胞与噬菌体。
6. 将噬菌体与细菌的混合物在适合指示菌株的温度下孵育 15–20 分钟（不超过 30 分钟）。
7. 准备营养软琼脂和硬琼脂平板： 在吸附反应进行的同时，将两支软琼脂管（预先融化并保存在 55 °C）放入实验台上的加热块中，加热块温度设定为 46–48 °C。
   • 融化的软琼脂必须在加热块中平衡 10–15 分钟。若软琼脂在加热块中放置超过 15 分钟，会开始凝固，倾注到硬琼脂表面时将形成凝块；若平衡时间少于 10 分钟，则软琼脂温度过高，加入噬菌体/细菌混合物后会杀死宿主细胞，导致无法形成菌苔，噬菌斑数量减少甚至无法检测。
   • 若需涂布噬菌体裂解液的连续稀释液，应准备额外的软琼脂管。
8. 在两个营养硬琼脂平板底部边缘（非盖子）标记至少包括姓名、日期、培养基类型以及与吸附管对应的“Phage”或“Control”信息。
   • 若进行连续稀释涂布，应额外准备并标记相应稀释倍数的平板。
   • 硬琼脂平板必须完全干燥，盖子上无冷凝水，并在加入软琼脂前预热至室温。若平板储存在 4 °C，应提前数小时甚至前一天取出。将其分散放置，堆叠高度不超过 2–3 个，呈交错排列，使其充分干燥。硬琼脂层中过多的水分会导致软琼脂被稀释，使噬菌体在噬菌斑形成过程中更容易在软琼脂中扩散，从而导致噬菌斑尺寸增大。
9. 依次逐个进行吸附管的涂布操作： 使用 P1000 微量移液器将噬菌体/细菌混合物（约 550 μl）无菌转移至一支软琼脂管中，然后迅速在双掌间旋转混匀。切勿剧烈振荡，以免引入气泡。左手持管，右手打开硬琼脂平板的盖子，立即将管内全部内容物倾注到硬琼脂平板表面。在关闭盖子前，轻轻但迅速地晃动平板，使融化的软琼脂在凝固前均匀覆盖整个平板表面。避免将软琼脂溅到培养皿侧壁。盖上盖子。
10. 对所有吸附管重复第 9 步操作，每次仅处理一支管。
11. 将平板置于水平台面上，静置不动，直至软琼脂完全凝固。
    • 通常 30 分钟即可完成凝固。
12. 将平板倒置进行孵育。
    • 多个平板可堆叠后用胶带固定，然后倒置进行孵育。

孵育结束后，可检查平板上的噬菌斑。阴性对照应仅显示均匀的细菌菌苔（无表明噬菌斑存在的孔洞）。噬菌斑在大小、形状和整体外观上有所差异。可通过无菌牙签小心穿刺单个噬菌斑的中心，将接种物转移至含有100至1000 μl液体培养基或噬菌体缓冲液的无菌微量离心管中，从而从形态各异的噬菌斑混合物中分离出特定类型的噬菌体。该裂解液可采用上述相同方法进行涂布。通常需要至少3至6次连续的单噬菌斑分离，以确保获得纯化的噬菌体。通常需要对裂解液进行较宽范围的稀释（10^-1至10^-10），以找到能够在平板上产生不重叠噬菌斑的滴度。所需稀释倍数取决于噬菌斑的大小。

6. 复制平板操作：转移细胞以筛选突变体和营养缺陷型菌株

该技术可将主平板上的细胞生长情况与次级平板进行比较，从而实现对细胞可选择表型的筛选。首先，通过涂布稀释液获得单菌落，或按照网格标记所指定的空间排列方式转移细胞，将细胞接种至主平板（又称母板）。随后，将主平板上各菌落中的细胞转移至含有生长抑制剂的培养基平板，或缺乏特定营养成分的次级平板中。菌落的空间排列模式首先通过将一块丝绒布按压到主平板表面来复制；由于细菌细胞对丝绒的亲和力高于对琼脂的亲和力，细胞会黏附在丝绒表面。接着，将丝绒上留下的细胞印迹转移至多个次级平板，使细胞生长呈现出与主平板相同的菌落分布模式。换句话说，该过程类似于使用橡皮图章，将一个平板上的生长模式复制到其他平板上。该技术的优势在于，可在单次实验中同时对大量菌落进行多种表型的筛选。

1. 准备主平板：在琼脂平板底部边缘（非盖子）标记至少包括您的姓名、日期和培养基类型的标识。
2. 在平板底部画出网格，至少包含两条等间距的垂直线和两条等间距的水平线。对形成的方格进行编号。
3. 使用预先灭菌的牙签将每个方格接种一种细胞样品。对于每份样品，轻触方格中心区域即可。不要将整个方格都涂满细胞（图8），否则在培养过程中样品会过度生长并污染相邻方格。
   • 每个方格接种不同的样品，样品来源可以是液体培养物或另一平板上的菌落。
4. 将主平板倒置并进行培养，后续将用于接种各种次级培养基。
5. 接种次级平板：将主平板与所有次级平板叠放在一起。用记号笔在平板侧面做一个方向标记。确保该标记位于每个平板的底部，而非盖子上。
6. 取一块无菌的丝绒布，将其放置在圆柱形支撑块上（图9）。使用固定夹将丝绒布固定在位，并注意记录支撑块上的方向标记。
   • 支撑块的尺寸应与培养皿底部相同（直径10.2 cm），并配有锁紧环，用于在复制接种过程中将丝绒布牢固夹紧在支撑块上。
   • 丝绒布（15.2 × 15.2 cm 的正方形）必须预先灭菌。将10至12块干净的丝绒布叠放后用铝箔包裹，然后在121 °C条件下使用干热灭菌程序（重力模式）高压灭菌30分钟。在用于复制接种实验前，需将其置于温热烘箱中数小时以确保完全干燥。注意：丝绒布在灭菌前可能需要用胶带去除绒毛。
   • 丝绒布可重复使用。使用后的丝绒布经高压灭菌去污染后，应以清水冲洗，并按上述方法重新灭菌。
   • 圆柱形支撑块及夹具在每次使用之间应以70%（v/v）乙醇或10%次氯酸钠溶液短暂冲洗进行消毒。
7. 打开盖子并将主平板倒置。将平板上的方向标记与支撑块上的标记对齐。将平板轻轻放下，使琼脂表面与圆柱形支撑块上的丝绒布接触。用指尖均匀而轻柔地按压主平板背面，然后小心地将主平板从支撑块上提起。重新盖上平板盖子。
   • 主平板在丝绒布上留下的细胞印迹可用于接种约7–8个次级平板，之后需更换新的丝绒布重新制作印迹。
8. 对每个次级平板重复步骤 #7。
   • 作为阳性对照，系列中的最后一个平板应使用所有测试菌株均能生长的琼脂培养基。这样可确认细胞已成功转移至系列中所有次级平板。否则，某一测试培养基上无生长可能被误判为细胞转移不足，而非菌株本身的表型特征。
   • 为避免假阳性结果，次级平板应按底物支持生长能力由弱到强的顺序排列。否则，营养物质可能在平板间转移，导致细胞在不适宜的培养基上生长。
9. 将平板倒置后进行培养。
   • 注意：在观察次级平板上的生长情况时，务必区分真正的生长与印迹残留。后者属于阴性结果。

7. 清理工作区域

1. 关闭本生灯，然后收好所有实验用品，包括平板或试管中的菌种、多余的培养基以及其他试剂。
   • 不要让陈旧的培养物（无论是平板还是试管）堆积在实验台或储存区域。这些样本是污染源的常见来源，如霉菌和不需要的细菌种类，一旦不再需要，应立即丢弃。
2. 将受污染的实验耗材（手套、移液器吸头、擦镜纸）、玻璃器皿（试管、烧瓶、瓶子）以及危险废物（细菌培养物或噬菌体溶液、使用过的平板）放入指定的废弃物容器中。处理非致病性材料时 E. coli 生物安全等级1级（BSL-1）菌株操作仅产生非感染性危险废物。当使用致病性生物体（BSL-2或更高级别）执行相同操作时，则会产生感染性危险废物。无论生物危害分类如何，危险废物在丢弃前必须经过高压灭菌或消毒处理。应遵循《生物安全微生物和生物医学实验室指南》（BMBL）第5版中所述的指导原则。^th Ed.) 以及您所在机构的环境健康与安全部门提供的指导，以立即并妥善处理实验过程中产生的生物危害物。
3. 用消毒剂清洁工作区域。
4. 使用抗菌皂和温水彻底洗手，然后离开实验室。

8. 代表性结果

划线分离技术 划线涂布法的一个应用示例如下所示 图1该方法用于从混合细胞培养物中分离细菌菌落，是微生物学和分子遗传学中最重要且必须掌握的技术之一。每个菌落代表一个遗传上完全相同的细胞群体。在许多后续实验中，必须以单个菌落或由单个菌落接种培养基获得的纯细菌培养物作为起始材料。例如，可通过光学显微镜观察菌落内单个细胞的形态；通过测序由单个菌落起始培养的细胞基因组DNA中的小亚基核糖体RNA基因来确定其遗传身份；还可通过将细胞进行多种生物化学和生理学检测来描述其代谢特性。只有使用纯培养物进行此类实验，才能准确归因特定微生物的特性，避免因培养物污染而导致结果混淆。若在划线接种过程中未能始终保持接种工具的无菌状态，则可能出现技术性错误。例如，忘记在不同象限之间灼烧接种环或更换新的牙签，将难以获得单菌落。某些细菌种类由于生长依赖于与其他细菌种类的共生协作关系，因而无法获得纯培养。这类被称为互养菌（syntrophs）的生物只能在共培养条件下生长，因此其形成的菌落（如果存在）始终包含两种或更多种微生物。在实验室中，使用环境样品来源的细菌进行平板划线操作时，另一个常见挑战是这些细胞的生长特性往往偏离传统实验室菌株，例如 E. coli某些细菌菌株可能形成丝状菌落（而非紧密的细胞簇），具有延伸至琼脂平板较大区域的分支，或发生钙化而难以被划线工具穿透，或被黏性荚膜包围，导致无法分辨单个菌落。这些特性使得采用划线平板法难以纯化出单菌落。

倾注平板技术 采用倾注平板法时，菌落在琼脂内部以及琼脂培养基表面均会形成，从而为计数样品中可存活细胞的数量提供了便捷手段。该方法广泛应用于多种工业领域。例如，对于负责处理由居民区、商业区、工业区以及农业活动所产生的液体废弃物（如污水、雨水渠径流）的污水处理厂而言，在完成广泛的净化过程后分析水样至关重要。经处理的废水（非饮用水）以多种方式被再利用——用于农业中非食用作物的灌溉、住宅卫生冲厕以及工业冷却塔——因此必须不含化学和微生物污染。饮用水（可饮用水）必须按照美国环保署（EPA）标准进行净化，并通过微生物平板法进行检测，以定量特定的人类病原体。如图所示 图10 是从公共饮水器采集的水样中细菌细胞形成的细菌菌落。鉴于饮用水经过净化处理，这些菌落由致病性细菌产生的可能性较低；然而微生物无处不在，即使是非致病菌株的污染也只能尽量减少，无法完全消除。再举一例，制药公司需要在新药的生产、储存和运输过程中评估其微生物污染程度，即生物负荷量。通过在工艺的不同阶段对药品取样，并采用倾注平板法进行接种，可快速测定其微生物载量，即污染细菌的数量。随后可制定相应的预防措施，以最大限度减少或消除微生物污染。进行倾注平板法时最常见的技术错误之一是样品与熔化的琼脂混合不充分，导致菌落成团聚集，从而使平板计数结果不准确。另一个常见错误是在琼脂温度过高时倾注，导致样品中许多细菌细胞被杀死。这一失误同样会影响平板计数的准确性，使结果低于样品中实际的菌落形成单位总数。

涂布平板法。涂布平板法在用于活菌计数方面，其用途与倾注平板法类似。然而，由于采用涂布平板法形成的菌落在琼脂培养基表面分布均匀，因此可从单个菌落中分离出细胞，并用于后续实验操作（例如，作为划线平板或液体培养的接种物）。涂布平板法在三种常见实验中具有重要作用，即富集、筛选和筛选实验。在这三种应用中，目标细胞类型均可从混合物中分离出来，并可在后续进行多种生化、生理或遗传学检测。

富集实验是指将混合培养物接种到特定培养基上，或在有利于目标微生物生长的环境条件下培养平板，从而促进样品中具有特定代谢特性、生长特征或行为的微生物生长。该策略并不抑制其他微生物的生长，但可使目标微生物在培养物中的数量相对于其他微生物增加。因此，在富集平板上形成的菌落很可能表现出反映目标基因型的表型特征。例如，若目标是从含有超过1000种不同细菌物种的环境样品中培养出固氮细菌，则将样品接种于缺乏氮源的培养基上，可富集那些能够利用一系列固氮相关基因所提供的代谢能力、从大气中合成氮化合物的细菌。

一种筛选实验包括将混合培养物接种到一种培养基上，该培养基仅允许含有特定基因或一组基因的细胞生长。当使用含有抗生素抗性基因的质粒转化细菌菌株时，这类实验在分子生物学实验室中十分常见。如果您的目标是仅培养重组细胞，即成功摄取质粒的细胞，那么将样品接种到添加了适当浓度抗生素的培养基上，即可筛选出对该特定药物具有抗性的细胞。

一种筛选实验包括将混合培养物接种到一种允许所有活细胞生长的培养基上；然而，可根据表型将具有目标基因型的细胞与其他细胞区分开来。这类实验在分子生物学实验室中十分常见，例如在进行诱变分析或克隆基因至质粒时。一个经典示例如图11所示，该实验利用了编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因；该酶可使细胞代谢X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷），即其天然底物乳糖的底物类似物。β-半乳糖苷酶对X-Gal的切割会产生不溶性的蓝色产物。因此，若培养基中含有X-Gal，并将含有野生型（有功能）或突变型（无功能）lacZ基因的细胞样品接种于该培养基上，则在培养后，携带功能性lacZ基因的野生型细胞会形成蓝色菌落，而携带非功能性lacZ基因的突变型细胞则形成无色（“白色”）菌落。

初学涂布平板技术时最常遇到的技术问题是细胞在琼脂表面分布不均。使用转盘和玻璃棒时，样品可能被吸收过快，导致菌落仅在平板中心区域形成。采用“科帕卡巴纳法”时，玻璃珠在琼脂表面被旋转搅动而非充分震荡，结果许多菌落沿平板外缘生长。无论哪种情况，菌落的分布均未能充分利用平板的全部表面积，可能导致细胞聚集并形成重叠菌落，从而使平板计数不准确或无法区分不同类型的细胞。

软琼脂覆盖技术。一种类似于用于计数细菌菌落的涂布平板法的操作可用于统计噬菌体的数量。在平板计数（cfu/ml）中，通常将30至300个细菌细胞涂布于琼脂表面；而在噬菌斑计数（pfu/ml）中，则是将100至400个具有感染性的噬菌体颗粒与10⁸至10⁹个宿主细胞混合，再铺于覆盖在硬质营养琼脂表面的一层软琼脂中。除非有相反证据，通常认为单个细菌细胞分裂并积累大量基因相同的细胞，形成一个称为菌落的单一簇。如前所述，当细胞成簇生长（例如成对、四联、链状或簇状）或具有阻碍单个菌落形成的生长特性（如荚膜）时，这一假设并不成立。对于噬菌斑的形成也采用类似的假设，即每个噬菌斑代表单个噬菌体的活性。但此说法仅在单个噬菌体感染单个细菌时成立。如果多个噬菌体颗粒感染同一个细菌会发生什么情况？这一问题涉及进行噬菌体实验时必须考虑的一个重要统计参数——感染复数（multiplicity of infection, MOI），即样品中具有感染性的噬菌体颗粒数量与宿主细胞数量的比值。由于部分细胞吸附多个噬菌体，而其他细胞仅吸附一个或未吸附噬菌体，因此应以较低的MOI（≤1）感染宿主细胞群体，以尽量降低单个细胞被多个噬菌体颗粒感染的概率。在进行噬菌斑计数以测定噬菌体储备液滴度时，采用噬菌斑形成单位（pfu）作为功能定义，可避免上述复杂情况带来的影响。

如图所示 图12，不同噬菌体的噬斑形态各异。有些噬菌体产生小型噬斑（图A），而另一些则形成大型噬斑（图B）。多种变量影响噬斑大小，其中包含导致这种差异的技术因素。例如，完全培养基和较厚的硬琼脂有助于形成较大的噬斑，因为宿主细胞能够支持噬菌体更长时间的增殖。较高的宿主细胞涂布密度（>10⁹ 每块平板上的菌落形成单位（cfu）数量过多会导致噬菌斑尺寸减小。使用较低浓度的软琼脂可提高噬菌体颗粒在软琼脂中的扩散速率，从而增大噬菌斑的尺寸。需注意，若底层硬琼脂平板未完全干燥，培养皿中残留的冷凝水或过多水分会稀释上层软琼脂，导致扩散速率非预期地增加。这种技术上的疏忽将导致同一种噬菌体的噬菌斑大小出现不一致的结果。

噬菌斑大小也与多种宿主细胞事件相关，包括吸附效率、潜伏期时长（从噬菌体吸附至宿主细胞到细胞裂解的时间段）以及爆发量（单次感染所释放的子代噬菌体数量）。若噬菌体颗粒在细菌生长的不同阶段感染宿主细胞，则可能观察到噬菌斑大小的异质性混合。例如，在对数生长期早期吸附的噬菌体所产生的噬菌斑更大，且子代噬菌体数量多于在对数生长期后期吸附的噬菌体。通常情况下，裂解性噬菌体产生清晰的噬菌斑，而溶原性噬菌体则形成浑浊的噬菌斑。然而，某些裂解性噬菌体会产生有趣的图案，例如图中所示的“靶心”状噬菌斑 图12B这些清晰的噬菌斑周围环绕着浑浊的晕圈，这是因为噬菌斑边缘的细胞尚未完全裂解，或可能对噬菌体感染具有抗性。温和噬菌体中观察到的“靶心”样模式，表现为具有浑浊中心并被透明环包围的噬菌斑。这种形态反映了感染复数（MOI）以及宿主细胞在裂解-溶原决策方面的生理状态。当细胞最初被噬菌体感染时，MOI较低，且由于营养丰富，细胞生长迅速，这共同促进了裂解性生长。随着越来越多的细胞被裂解，MOI升高，形成透明的噬菌斑。然而，噬菌斑中心的溶原菌因对裂解具有免疫力而继续生长，从而产生具有浑浊中心的透明噬菌斑。

覆盖技术可进行改良，用于真核病毒的蚀斑试验。正如噬菌体可在软琼脂中的细菌菌苔上形成蚀斑一样，真核病毒也可在覆盖有凝胶的细胞单层上形成蚀斑。单层细胞是指在培养皿表面并排生长、相互接触但不重叠的融合细胞层。进行此类蚀斑试验时，将病毒等分试样加入易感的真核细胞单层中，随后用基于琼脂糖的营养培养基覆盖该单层细胞。这种凝胶可限制感染细胞释放的子代病毒向单层中邻近细胞的扩散。因此，会形成球形区域（即蚀斑），其中的细胞因病毒粒子释放而受损。为了便于观察蚀斑，可向细胞培养物中加入可染色活细胞的染料，使感染细胞与未感染细胞之间形成对比。

软琼脂覆盖技术可用于噬菌斑测定以外的实验。首先，需要明确的是，硬质营养琼脂是一种支持基质，可允许细菌生长。其次，用于覆盖的软琼脂其营养成分可与硬琼脂不同。因此，软琼脂可作为检测细菌菌株多种生长特性或代谢特性的手段。例如，该覆盖技术可用于筛选能够降解纤维素的细菌（Teather 和 Wood，1982）。先在非选择性硬琼脂培养基上培养单菌落，然后在硬琼脂表面铺上含有0.1%（w/v）羧甲基纤维素（CMC）的软琼脂。培养后，向平板中加入染色剂，使菌落周围软琼脂中出现的透明圈得以可视化。透明圈的形成是由于细菌分泌的水解酶降解了培养基中的纤维素所致。近年来，该覆盖技术还被用于检测抑制反刍动物瘤胃中产甲烷古菌生长的细菌（Gilbert et al. 2010）。将环境样品中的细菌分离物在硬质营养琼脂培养基上培养后，再用含有产甲烷菌培养物的软琼脂覆盖菌落。培养后，观察菌落周围是否存在生长抑制圈。该方法可用于鉴定在软琼脂中产生产甲烷菌抑制物的细菌菌株。

软琼脂覆盖技术中最常见的技术错误是在软琼脂融化后温度过高或过低时进行倾注。若温度过高，混入培养基中的细菌细胞会在接种前被杀死；若温度过低，则软琼脂在倒入硬琼脂表面时会形成团块。无论哪种情况，结果都将难以判断，甚至无法读取。

影印平板法。当需要将多种菌株从一种培养基转移到另一种培养基以测试其生长需求时，若菌株数量较多，该过程会变得极为繁琐。影印平板法是一种可同时筛选大量微生物的方法。例如，在对野生型细胞培养物进行诱变处理后，可将该培养物进行梯度稀释并涂布于平板上，以获得含有单菌落的平板。原始平板中含有能够支持所有细胞生长的完全培养基，包括能够合成生长所需全部化合物的野生型原养型菌株，以及因生物合成途径中发生基因突变而无法合成某些生长必需化合物的突变型营养缺陷型菌株。通过将细胞混合物接种至完全培养基上，营养缺陷型菌株可从环境中摄取其所缺失的营养物质而生长。为了区分原养型菌株与营养缺陷型菌株，可将菌落影印至基本培养基上，只有原养型菌株能够生长。由于影印后菌落的空间排列模式与原始平板保持一致，通过比较次级平板与原始平板的生长情况，即可识别出突变菌落。为进一步确定突变菌株无法合成的具体化合物，可将菌落进一步影印至补充有特定成分（如氨基酸、碳源、维生素等）的基本培养基上。通过影印平板法，可同时筛选数百个菌落。一种可能出现的技术误差是使用了含水量过高的琼脂平板，导致菌落扩散重叠，造成平板上所有培养物交叉污染，从而产生完全不可靠的结果。另一种技术误差是在将菌体从绒布转移到次级平板时施加过大压力。同样，在次级平板培养后，可能导致菌落相互重叠，使生长表型被误判为污染所致，而非真正的营养缺陷型特征。

并非所有野生型微生物物种都是原养型生物，因此可通过影印平板法同时筛选不同野生型菌株的特征性生长需求。如图所示 图13，来自四种不同细胞的“dabs” 假单胞菌 将细菌菌株以完全培养基 YTA 接种于带有网格标记的平板上，每个菌株设两个重复（图 A）。随后将菌株转接到三种不同的次级平板上（图 B、图 C 和图 D），次级平板由添加了不同碳源的最低限度培养基（MSA）组成，分别为乙酰胺、乳糖和甘氨酸。结果表明，在四个菌株中，有两个菌株 假单胞菌 菌株（P. aeruginosa 和 P. stutzeri）无法在这三种碳源上生长。作为对照，将菌株转印至第四个含有YTA培养基的平板，以确认整个操作过程中细胞均被成功转移。由于所有四种菌株均能在YTA对照平板上生长，因此在前述三个平板中观察到的生长缺陷是可靠的。复制平板的结果已汇总于 表1一个常见的错误是将次级平板上生长痕迹的印迹误判为阳性结果。例如，比较以下表型： P. aeruginosa 与……相同 P. stutzeri 在MSA+乙酰胺培养基上（图B）。后者显示的是生长印记，属于阴性结果，可能由于前一培养板中的营养物质随亲代细胞转移所致。由于子代细胞无法获得缺失的营养物质，因此不会发生新的细胞生长。生长印记容易与真实生长混淆。如有疑问，应采用替代方法重复实验，例如将原始培养板上的细胞划线接种至次级培养基上。

图1. 平板上单菌落的示例。位于平板中央附近的粉红色球状物为菌落 粘质沙雷菌一种革兰氏阴性、杆状的肠杆菌科变形菌。由于其偏好潮湿环境，该微生物常在浴缸角落、水槽盆内、瓷砖填缝剂中以及淋浴帘上生长。 S. marcescens 因其可产生一种名为灵菌红素的红色色素而易于识别。本平板上的菌落采用划线平板法获得，经培养后，单个菌落出现在第四象限 30 °C 24小时后。其余三个象限显示汇合生长，其中沉积在琼脂表面的细胞形成了重叠的菌落。

图 2. 用于划线平板技术的器械。从上到下依次为牙签（压扁的而非圆形的）、金属接种环、一次性塑料接种环和木质接种棒。牙签通常将较宽的一端朝下放入小玻璃烧杯中，用铝箔覆盖后经高压灭菌，使用前进行灭菌处理。木质接种棒则放入18 mm试管中，经高压灭菌后使用。

图3. (A) 使用四区划线法进行平板划线。采用预先灭菌的接种环、接种针或牙签，从培养皿边缘向中心快速、平稳地来回划线，将样品涂布于琼脂表面的四分之一区域。此操作依次在培养皿的四个象限中重复进行。培养后，菌体生长沿接种工具在平板上划过的路径显现。通过该技术对混合样品中的细胞进行机械分离，应在第四象限获得单菌落（参见图1示例）。单个菌落称为菌落形成单位（cfu）。(B) 若使用金属接种环进行划线，每次接触接种物或琼脂培养基前，必须将其置于本生灯火焰中灭菌。请注意，火焰中最热的区域为蓝色锥体的尖端。手持接种环手柄，将金属丝部分置于火焰中，距离接种环约3-4英寸处，停留至金属丝烧至红热。随后移动金属丝，使火焰逐渐接近接种环部分。务必在接种环接触接种物前使其充分冷却。

图 4. 倾注平板法。（A）用 5.0 ml 血清移液管将少量样品（0.1 至 1.0 ml 之间）无菌地加入一个空的但已灭菌的培养皿中。（B）将熔化并平衡至约 48 °C 的琼脂倒入含有样品的培养皿中。盖上皿盖后，轻轻旋转培养皿以混合样品与熔化的琼脂。琼脂静置约 30 分钟使其凝固，随后将平板倒置进行培养。

图5. 使用转盘和玻璃涂布棒的涂布平板法。将琼脂平板放置在转盘上后，用微量移液器将少量样品（0.1 至 0.2 ml）无菌地加至平板中央。将涂布棒浸入盛有乙醇的烧杯中进行灭菌，然后通过本生灯火焰灼烧以去除多余的乙醇。在接触样品前，应将涂布棒轻触平板边缘附近的琼脂以冷却。当转盘缓慢旋转时，用涂布棒在样品中轻轻前后移动，使样品在整个平板表面逐渐而均匀地涂布。关闭皿盖后，将平板静置于实验台面上至少5分钟，以使样品完全被琼脂吸收，之后再倒置平板进行培养。

图6. 使用玻璃珠的涂布平板法（科帕卡巴纳法）。将已在高压灭菌器中预先灭菌的玻璃珠倒入置于实验台上的琼脂平板表面。使用微量移液器将少量样品（100 至 150 μl）无菌地加至琼脂平板中央。盖上平板盖后，通过水平摇动的方式轻轻来回晃动玻璃珠6到7次，使样品均匀涂布。然后将平板旋转60°，重复该摇动操作。再旋转60°后，再次重复摇动过程。待样品完全被琼脂培养基吸收后，将玻璃珠倒入含有10%次氯酸钠溶液的烧杯中。随后将平板倒置进行培养。

图7. 利用软琼脂覆盖技术分离并计数噬菌体，依据是噬菌斑的形成（也称为噬菌斑测定法）。(A) 噬菌体的存在可表现为软琼脂中密集生长的细菌菌苔上出现的透明区域，即噬菌斑。T4噬菌体是一种烈性双链DNA噬菌体，可感染其宿主Escherichia coli，导致宿主细胞裂解并释放子代噬菌体。经过多轮感染和裂解后，最初被感染宿主细胞周围区域的邻近E. coli细胞消失，形成含有数十亿T4噬菌体颗粒的噬菌斑。T4噬菌体产生的噬菌斑直径约为1 mm。在本实验中，将200 μl浓度为2 × 10⁸ pfu/ml的T4噬菌体原液经10^-5稀释后的样品，与约300 μl处于37 °C振荡培养条件下对数生长期的E. coli指示菌液混合。将噬菌体和细菌共同加入EHA软琼脂管中混匀，然后倾注于EHA硬琼脂平板表面。需要注意的是，本实验无需在涂布前进行噬菌体与细菌的吸附步骤。将软琼脂在静置条件下凝固20分钟后，将平板倒置，并于37 °C培养24小时。(B) 在无感染性噬菌体颗粒存在时，细菌生长导致软琼脂中形成浑浊的细胞悬液，无法观察到独立的菌落。相反，本实验中的E. coli在整个软琼脂层中形成均匀的菌苔。

图8. 细菌样品初代平板（主平板）的制备。为保持样品有序，可在平板底部标记出网格，并对形成的方格进行编号，每个样品分配一个方格。图中展示了正确与错误接种模式的示例。理想情况下，应使用无菌接种工具（如牙签）蘸取少量细胞，将其点种于方格中心（如第4号方格）。常见的接种错误，如第5号方格（“块状接种”）和第6号方格（“填满式接种”）所示，会导致培养后细菌过度生长，进而污染相邻方格。

图9. 复制平板技术用于将细胞从主平板转移到次级平板，以进行表型筛选。将主平板上的标记与覆盖有绒布的支撑块上的标记对齐，然后缓慢放下，使琼脂表面接触绒布。用指尖轻而均匀地按压主平板，使细胞转移到绒布上。此操作会在绒布上留下与主平板空间分布一致的细胞印记。随后采用相同步骤，将细胞从绒布转移至次级平板。利用绒布上同一主平板的印记，可接种多达7–8个次级平板。从绒布接种的最后一个平板应作为阳性对照，使用支持所有测试菌株生长的培养基，以确保在整个系列平板中均实现了充分的细胞转移。培养后，可对次级平板进行观察并记录有无生长。因此，在单次实验中即可同时在多种培养基上筛选大量细菌菌株。

图10. 采用倾注平板法的示例结果。取自公共饮水器的1.0 ml水样被加入无菌空培养皿中，随后将已融化并冷却的YTA培养基倒入含有样品的培养皿中。该琼脂培养基还含有100 μg/ml的放线菌酮，以抑制水样中可能存在的酵母菌和霉菌的生长。轻轻旋转混匀后，将培养皿置于水平台面上，使琼脂完全凝固。将平板在37 °C下培养48小时。图中显示了本实验的结果。请注意表面菌落与内部菌落外观上的差异：表面菌落较大且呈圆形，而内部菌落因凝固的培养基限制了其扩散，故非常微小且形状不规则。

图11. 使用涂布平板法获得的示例结果。本实验采用“Copacabana法”将大肠杆菌细胞混合物涂布于平板上进行筛选。在此情况下，培养基（LB）中含有X-Gal，因此表达有功能的β-半乳糖苷酶的细胞形成蓝色菌落，而lacZ基因发生突变、无法表达有功能的β-半乳糖苷酶的细胞则形成白色菌落。这种可在一个平板上清晰区分两种菌落的方法常被称为“蓝白斑筛选”。

图12. 使用软琼脂覆盖法进行噬菌斑实验的示例结果。图中显示在宿主菌株上形成的噬菌斑 Mycobacterium smegmatis mc²155（ATCC 700084）被两种不同噬菌体感染：（A）分枝杆菌噬菌体Destroyers 和（B）分枝杆菌噬菌体MSSS。这些噬菌体由加州大学洛杉矶分校（UCLA）2010年春季MIMG 103L实验课程的学生分离获得。M. smegmatis 是一种非致病性放线菌，属于分枝杆菌科，该科包含少数可引起结核病等严重疾病的致病菌结核分枝杆菌，非洲分枝杆菌，牛分枝杆菌）和麻风病（M. leprae）。大约 50 μl 10 的^-2 破坏剂的稀释与10^-3 每份MSSS稀释液分别孵育 500 μl 的 M. smegmatis 20 分钟 37 °C 然后与MBTA（软琼脂）混合，倾注于MHA（硬琼脂）平板上。静置20分钟使软琼脂完全凝固后，将平板倒置，在指定温度下培养 37 °C 孵育48小时。注意每种噬菌体产生的不同噬菌斑形态。Destroyers（A）形成小而清晰的噬菌斑（平均直径约1 mm），这是裂解性噬菌体的典型特征；而MSSS（B）则形成较大的“靶心样”噬菌斑，其中心清晰，周围环绕着浑浊的晕环（平均直径约3.2 mm）。该模糊环可能由对噬菌体感染具有抗性的细菌组成。这种模式与溶原性噬菌体形成的浑浊噬菌斑明显不同。

图13. 使用复制平板法的示例结果。四个 假单胞菌 菌株（铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌和斯图氏假单胞菌) 在三种不同的碳源（乙酰胺、乳糖和甘氨酸）上进行生长测试，每种条件设两个重复。（A）初筛平板为完全培养基（YTA），按所示接种四种菌株。于37℃培养后 30 °C 培养24小时后，所有四种菌株均在YTA培养基上生长。将原始平板复制到以单一碳源补充的最小培养基（MSA）上：乙酰胺（B）、乳糖（C）和甘氨酸（D）。系列中的最后一块平板为阳性对照YTA平板（E）。如图所示，各菌株在次级平板上孵育后表现出不同的生长模式。需注意，有时难以区分实际生长与细胞压印痕迹。例如，比较由 P. stutzeri 在三块MSA平板上从无生长到相同三块平板上无生长 P. aeruginosa与所表现出的生长模式相比，两者均为阴性结果 P. putida 和 P. fluorescens然而，所有菌株均在阳性对照平板上生长，证实系列中的每个次级平板均成功接种了细胞。本实验结果已汇总于下表。 表1.

	YTA （初级培养基）	MSA + 乙酰胺	MSA + 乳糖	MSA + 甘氨酸	YTA （对照）
P. aeruginosa	+	-	-	-	+
P. putida	+	+	+	+	+
P. fluorescens	+	+	+	+	+
P. stutzeri	+	-	-	-	+

表1. 复制平板实验结果汇总。生长以加号（+）表示，无生长以减号（-）表示。YTA为完全培养基（酵母胰蛋白胨琼脂），MSA为基本培养基（最低盐琼脂）。MSA平板中添加了如所示的单一碳源。

讨论

微生物培养涉及多种平板接种方法，所有这些方法都要求在细胞和培养基操作过程中始终保持无菌技术。本实验方案描述了五种不同的操作步骤。尽管这些平板接种技术通常用于操作细菌和噬菌体，但也可应用于分子遗传学研究中常用的哺乳动物细胞培养以及真核微生物，例如酵母（如 Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe）、藻类和原生动物（如 Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium）以及线虫（如 Caenorhabditis elegans）。根据实验目的或研究对象的不同，每种平板接种方法还存在大量更为复杂的变体。因此，不仅需要为特定实验或目标微生物选择最合适的技术，还应针对性地优化方法，以确保实验结果能够有效回答科研问题或解决具体问题。

本实验方案中讨论的平板接种技术，其部分最新应用涉及能够实现高通量筛选和药物发现实验的技术进步。例如，基因组测序中心采用“Copacabana法”进行克隆文库的涂布平板操作，该文库为经质粒转化的大肠杆菌（E. coli），其中质粒含有源自微生物基因组的DNA片段。由于需一次性制备数十个大型平板（称为生物测定板），因此使用自动平板摇床对整批培养板中的玻璃珠进行振荡。此外，在培养后从这些平板上挑选菌落时，采用机器人菌落挑选仪，从目标菌落中收集细胞，作为接种物接种至含有LB肉汤的384孔微孔板中。在此高通量筛选实验中，涂布平板技术的操作原理仍然适用，但借助技术手段实现了多个步骤的自动化和规模化，从而可在短时间内同时分析大量样品。

生物技术和制药公司在微生物学与分子遗传学最基本技术的高通量化方面投入了大量资源。例如，已有可同时对8个或12个样品进行液体转移的多通道移液器。甚至还有可操控96通道移液头的机器人工作站！这些工作需要多学科科研团队的协作，将具备方法学专长的生物学家与能够开发实验所需仪器的工程师和计算机程序员配对合作。无论研究应用为何，开发这些技术的公司所共同追求的目标都是一致的——实现实验室流程、工具、系统和仪器的自动化，使其更少依赖人力并提高效率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. 酵母胰蛋白胨琼脂（YTA） <表格 边框="1">
酵母提取物	2.0 g
胰蛋白胨	10.0 g
琼脂	15.0 g
蒸馏水	最多1000.0 ml
	pH 7.0

121℃高压灭菌°C 下灭菌 20 分钟。储存于 4°C.

若为倾注平板法准备试管，需将琼脂冷却至约55 ℃°然后加入 2.0 ml 的 50 mg/ml 放线菌酮。无菌条件下将融化的琼脂每管分装 18.0 ml 至 18 mm 试管中，随后在 4 ℃ 保存°C. 琼脂会凝固，使用前需在蒸锅或微波炉中融化。

2. 最小盐琼脂（MSA）+ 0.1%（w/v）碳源

<表格 边框="1"> NH₄Cl 1.0 g NH₂HPO₄•2H₂O 2.14 g KH₂PO₄ 1.09 g MgSO₄₄•7H₂O 0.2 g 碳源* 1.0 g 微量盐溶液** 10.0 ml 琼脂 15.0 g 蒸馏水 最多 1000.0 ml pH 7.0

121℃高压灭菌°C 下灭菌 20 分钟。储存于 4°C.

图13中所示实验所用的碳源包括acetamide、lactose和glycine。

** 微量盐溶液的配制方法如下：用 0.1 N HCl 溶解，于灭菌前加入基础培养基中（121 ℃ 高压灭菌）°C，20 分钟）。

<表格 边框="1"> FeSO₄•7H₂O 300.0 mg MnCl₂•4H₂O 180.0 mg Co(NO₃)₂•6H₂O 130.0 mg ZnSO₄.7H₂O 40.0 mg H₂MoO₄ 20.0 mg CuSO₄₄•5H₂O 1.0 mg CaCl₂ 1000.0 mg HCl（0.1 N） 最多1000.0 ml

3. EHA 软琼脂（0.65 % w/v）

<表格 边框="1"> 琼脂 6.5 g 胰蛋白胨 13.0 g NaCl 8.0 g 柠檬酸钠•2H₂O 2.0 g 葡萄糖 3.0 g 蒸馏水 最多 1000.0 ml

121℃高压灭菌°C下灭菌20分钟。4 ℃保存°C.

4. EHA 硬琼脂（1.2% w/v）

<表格 边框="1"> 琼脂 12.0 g 胰蛋白胨 13.0 g NaCl 8.0 g 柠檬酸钠•2H₂O 2.0 g 葡萄糖 3.0 g 蒸馏水 最多 1000.0 ml

121℃高压灭菌°C 下灭菌 20 分钟。储存于 4°C.

5. 1× Middlebrook 上层琼脂（MBTA 软琼脂，0.5% w/v）

<表格 边框="1"> 100 mM CaCl₂ 菌种保藏 1 ml 7H9 液体培养基： 整洁 ** 50 ml 2XTA *** 50 ml

熔化50 ml的2XTA，使其冷却至约55℃°C. 采用无菌技术，向其中加入 CaCl₂ 以及将7H9肉汤加入熔化的琼脂中。每支13 mm试管中无菌分装4.5 ml该混合物，并置于55 ℃保存°C 培养箱 ≤7 天。将 MBTA 冷却至室温或 4°C 将导致 CaCl₂ 从溶液中沉淀析出。

* 100 mM CaCl₂₂. 储存时必须置于室温，以防止 CaCl₂ 从溶液中析出沉淀。

** 7H9 液体培养基：原液

<表格边框="1"> 7H9肉汤基础 4.7 g 40%甘油菌种保存液 5 ml 蒸馏水 最多 900.0 ml

将基础培养基与水混合，边搅拌边加入甘油。在121℃下高压灭菌。°C 下灭菌 20 分钟。储存于 4°C.

*** 2X 中间布罗克顶层琼脂（2XTA，1.0% w/v）

<表格 边框="1"> 7H9肉汤基础 4.7 g 琼脂 1.0 g 蒸馏水 最多1000.0 ml

121℃高压灭菌°C下灭菌20分钟。将50 ml分装至100 ml瓶中，4 ℃保存°C.

6. Middlebrook 7H10 琼脂平板（MHA 硬琼脂，1.9% w/v）

<表格 边框="1"> 7H10 琼脂基础 19.0 g 40% 甘油菌种保存液 12.5 ml 蒸馏水 887.5 ml

将琼脂基础与水混合，然后在搅拌的同时加入甘油。加热溶液至沸腾，继续搅拌一分钟，以完全溶解基础粉末。在121℃下高压灭菌。°C，20 分钟以达到灭菌效果。将琼脂冷却至约 55°C 然后无菌添加以下试剂：

<表格 边框="1"> AD 补充剂（预热至 37°C)* 100 ml 50 mg/ml 羧苄青霉素 ** 1.0 ml 10 mg/ml 放线菌酮 ** 1.0 ml

* AD 补充剂

<表格 边框="1"> NaCl > 17 g > 白蛋白（V组分）> 100 g> 葡萄糖（D-葡萄糖> 40 g> 蒸馏水> 最多 2000.0 ml>

过滤除菌此溶液，切勿高压灭菌。4℃保存。°C.

** 过滤除菌后，将这些溶液在 4 ℃ 保存°C for ≤60 天

7. LB 琼脂（1.5% w/v）+ X-Gal（60 μg/ml

<表格 边框="1"> 胰蛋白胨 10.0 g 酵母提取物 5.0 g NaCl 10.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 最多 1000.0 ml pH 7.5（25 ℃时）°C 121℃高压灭菌°C，20 分钟以灭菌。让琼脂冷却至约 55°C 然后无菌加入 3.0 ml 20 mg/ml 的 X-Gal 溶液。通过将 400 mg X-Gal 溶解于 20 ml 二甲基甲酰胺（DMF）中，新鲜配制 X-Gal 储存液。

特定试剂表：

<表格 边框="1"> 试剂名称 公司 目录编号 酵母提取物 Becton Dickinson 212750 胰蛋白胨 Becton Dickenson 211705 琼脂 贝克顿·迪金森 214030 NH₄Cl Acros Organics 123340010 NH₂HPO₄•2H₂O Sigma-Aldrich 30435 KH₂PO₄ Fisher Scientific BP 303-500 MgSO₄₄•7H₂O Sigma-Aldrich 230391 乙酰胺 Sigma-Aldrich A-0500 乳糖 Fisher Scientific L6-500 甘氨酸 Sigma-Aldrich G-7126 FeSO₄•7H₂O Sigma-Aldrich F8048 MnCl₂•4H₂O Sigma-Aldrich M-3634 Co(NO₃)₂•6H₂O Sigma-Aldrich 230375 ZnSO₄₄.7H₂O Sigma-Aldrich Z4750 H₂MoO₄ Acros Organics 213621000 CuSO₄₄•5H₂O Sigma-Aldrich 209198 CaCl₂ Sigma-Aldrich C1016 HCl Fisher Scientific A144-212 环己酰亚胺 Sigma 038K1561 羧苄青霉素 Cellgro 46-100-RG NaCl Fisher S271-1 柠檬酸钠•2H₂O Fisher S279-500 葡萄糖（右旋糖） BD 215530 7H9肉汤基础 BD 271310 7H10 琼脂基础 BD 262710 甘油 Shelton IB15760 白蛋白（V组分） Fisher S71907 X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）β-D-半乳吡喃糖苷) Teknova X1205 二甲基甲酰胺（DMF） Sigma D4551 乙醇 Fisher CDA19 氯漂白剂 Chlorox 02490/06644884 CiDecon（消毒剂） Decon Laboratories, Inc. 8504

特定仪器表格：

<表格 边框="1"> 设备名称 公司 目录编号 实验 金属环 美国教育产品 S17352 划线平板法 一次性塑料接种环 Fisher 22-363-602 划线平板法 木签 Fisher 23-400-104 划线平板法 扁平牙签 美国教育产品 S67859 划线平板法 转盘 Fisher 08-758Q 涂布平板法 玻璃棒 Bellco Glass NC9004380 涂布平板法 4 mm 玻璃珠 Fisher 11-312B 涂布平板法 丝绒布 Bel-Art 产品 09-718-2 影印平板法 圆柱形块 Bel-Art 产品 09-718-1 复制平板接种法