在免疫缺陷小鼠中构建人类微血管网络的生物工程方法

摘要

本文介绍一种将人脐带血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）和骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）包埋于胶原蛋白/纤连蛋白凝胶中，皮下植入免疫缺陷小鼠的方法。该细胞与凝胶的组合可形成功能性人源血管网络，并与小鼠的脉管系统相连接。

摘要

组织工程和基于细胞的组织再生治疗的未来，很可能取决于我们在体内生成功能性血管网络的能力。在这方面，寻找用于在体内构建血管网络的实验模型显得尤为重要¹。体内生物工程微血管网络的可行性最早是通过使用来源于人体组织的成熟内皮细胞（ECs）得以证实的^2-4；然而，这类自体来源的内皮细胞在广泛临床应用中存在困难，因其难以获取足够数量，且需从现有血管系统中进行采集。这些局限性促使人们开始探索其他EC来源。血液中内皮集落形成细胞（ECFCs）的发现，为无创获取内皮细胞提供了可能^5-7。我们及其他研究者已证实，成人及脐带血来源的ECFCs具有在体内形成功能性血管网络的能力in vivo^7-11。重要的是，这些研究还表明，为了获得稳定且持久的血管网络，ECFCs必须与血管周围细胞共同移植。本文所描述的实验方法正是说明了这一原理：我们展示了如何将人脐带血来源的ECFCs与骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）混合为单细胞悬液，并将其包埋于胶原蛋白/纤连蛋白/纤维蛋白原凝胶中，植入免疫缺陷小鼠体内后可在7天内形成功能性人源血管网络。在植入物中可观察到由人ECFC衬覆的管腔结构，其中含有宿主红细胞，这不仅表明了血管网络的从头（de novo）生成，也证明了其与宿主循环系统之间功能性吻合的建立。这种生物工程化人源血管网络的小鼠模型，非常适用于研究人血管网络形成的细胞与分子机制，以及开发工程化组织血管化的策略。

方案

1. 准备

1. 配制 EGM-2 培养基（500 mL）
   • 将 100 mL 胎牛血清（FBS）加入 395 mL 内皮细胞基础培养基（EBM-2）中。
   • 加入 5 mL 100 倍谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液（GPS）。
   • 加入 EGM-2 SingleQuots 补充剂中的所有成分，但氢化可的松除外（即 VEGF、hFGF-B、R-IGF-1、hEGF、肝素、抗坏血酸和 GA-1000）。
   • 使用孔径为 0.2 μm 的真空滤器过滤除菌。
2. 配制 MSCGM 培养基（500 mL）
   • 将 5 mL 100 倍 GPS 溶液加入 440 mL 间充质干细胞基础培养基（MSCBM）中。
   • 加入 MSCGM SingleQuots 试剂盒中的全部内容物。
   • 加入来自 EGM-2 SingleQuots 补充剂的 hFGF-B 分装液。
   • 使用孔径为 0.2 μm 的真空滤器过滤除菌。
3. 配制 DMEM 培养基（500 mL）
   • 将 50 mL 胎牛血清（FBS）加入 440 mL 1 倍高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中。
   • 加入 5 mL 100 倍 GPS 溶液。
   • 加入 5 mL 非必需氨基酸溶液。
   • 使用孔径为 0.2 μm 的真空滤器过滤除菌。
4. 配制胶原蛋白/纤连蛋白溶液（3.6 mL；注射当天配制）
   • 将 0.4 mL 10 倍 DMEM 加入 150 μL 蒸馏 H₂O 中。
   • 加入 100 μL 1 M HEPES 溶液（终浓度 25 mM）。
   • 小心加入 2.4 mL 牛胶原蛋白（储存液浓度为 5 mg/mL，终浓度为 3 mg/mL），并在冰上轻轻混匀。
   • 通过加入 1 N NaOH 溶液（约 30 μL）调节 pH 至中性。
   • 使用酚红指示剂判断中性 pH；也可使用 pH 试纸监测 pH。
   • 加入 120 μL 人纤连蛋白（储存液浓度为 1 mg/mL，终浓度为 30 μg/mL）。
   • 加入 0.4 mL FBS（终浓度为 10%）。
   • 使用前将溶液置于冰上保存。
5. 配制纤维蛋白原溶液（1 mL；注射当天配制）
   • 将 30 mg 粉末状纤维蛋白原加入 1 mL 0.9 N NaCl 溶液（pH 7.4）中（终浓度为 30 mg/mL）。
   • 使用前将纤维蛋白原溶液在 37°C 下孵育 30 分钟。
   • 加入胶原蛋白/纤连蛋白凝胶前，轻轻混匀，避免涡旋振荡。
6. 配制凝血酶溶液（200 mL）
   • 将 1 KU 粉末状凝血酶加入 200 mL 0.9% NaCl 生理盐水中（终浓度为 50 U/mL）。
   • 使用孔径为 0.2 μm 的注射器滤器过滤除菌，并于 -20°C 保存至使用。
   • 使用前用 0.9% NaCl 生理盐水稀释至终浓度为 10 U/mL。
7. 配制 1% 明胶溶液（500 mL）
   • 将 5 g 粉末状明胶加入 500 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   • 在 121°C 下高压灭菌 30 分钟。
   • 使用孔径为 0.2 μm 的真空滤器过滤除菌。
8. 使用 1% 明胶包被液 对 100-mm 组织培养皿进行 包被
   • 向每个 100-mm 组织培养皿中加入 10 mL 1% 明胶溶液。
   • 在 37°C 下孵育 60 分钟。
   • 使用前弃去明胶溶液，并用 PBS 洗涤一次。

2. 人脐带血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）的培养

本方案假设实验前实验室已备有冻存的内皮集落形成细胞（ECFC）冻存管。ECFC可从脐带血或成人外周血的单个核细胞组分中分离获得，分离方法如前所述⁷。

1. 从液氮储存罐中取出一支ECFCs冻存管（通常含0.5-1×10⁶个细胞，溶于1 mL冻存液中），立即将其内容物加入含有10 mL DMEM培养基的15 mL锥形管中稀释。以1200 rpm离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL预温的EGM-2培养基中。
2. 将10 mL ECFC悬液接种至一个经1%明胶包被的100 mm组织培养皿中。将培养皿置于37°C、5%CO₂的加湿培养箱中。次日，轻轻吸除未贴壁的细胞和培养基，并向贴壁细胞中加入10 mL新鲜EGM-2培养基。
3. 每2-3天用EGM-2培养基更换一次培养基。继续培养细胞，直至培养皿表面形成融合的单层细胞。当细胞达到融合状态时，按以下步骤进行传代：
4. 吸除培养基，并用10 mL PBS洗涤细胞。
5. 移除PBS，向每个100 mm培养皿中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻摇动培养皿使胰蛋白酶-EDTA溶液均匀分布。在37°C、5%CO₂条件下孵育3-5分钟。轻敲培养皿，在倒置显微镜下观察细胞是否已悬浮脱落。
6. 当细胞完全脱落时，加入8 mL EGM-2培养基，将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。取10 μL进行血细胞计数板计数，并计算收获的总细胞数。
7. 使用EGM-2培养基，将细胞以5,000个细胞/cm²的接种密度接种至经1%明胶包被的组织培养皿中。将培养皿放入培养箱中，并每2-3天用EGM-2培养基更换一次培养基。

对后续传代重复此操作。在细胞群体扩增过程中记录传代次数。内皮集落形成细胞（ECFCs）将在第4至第8代之间使用。

3. 人骨髓来源间充质干细胞（MSCs）的培养

本方案假设实验前实验室已备有人类间充质干细胞（MSC）的冻存管。MSC可从骨髓抽吸物中分离获得，方法如前所述¹¹。

1. 解冻一管MSCs（通常为0.50–1×10⁶ 从液氮储存罐中取出1 mL冻存液中的细胞，立即加入含有10 mL DMEM培养基的15 mL锥形管中稀释。以1200 rpm离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL预热的MSCGM培养基中。
2. 将10 mL MSC悬液加入一个未包被的100 mm组织培养皿中。将培养皿置于37°C、5% CO₂的湿化培养箱中培养。₂次日，轻柔吸除未结合的细胞和培养基，并用10 mL新鲜MSCGM培养基喂养已结合的细胞。
3. 每2-3天用MSCGM培养基换液一次。培养细胞至其融合度达到80%的单层细胞密度。当细胞融合度达到80%时，按以下步骤进行传代：
4. 吸除培养基，用 10 mL PBS 洗涤细胞。
5. 吸除 PBS，向每个 100 mm 培养皿中加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。轻轻摇晃培养皿，使胰蛋白酶-EDTA 溶液均匀分布。于 37°C、5%CO2 条件下孵育 3–5 分钟。轻敲培养皿，于倒置显微镜下观察悬浮的脱落细胞。
6. 当细胞完全脱落时，加入8 mL MSCGM培养基，将细胞悬液收集至15 mL锥形离心管中。取10 μL进行血细胞计数板计数，计算收获的细胞总数。
7. 将细胞以每平方厘米10,000个细胞的接种密度接种于未包被的组织培养板中² 使用MSCGM培养基。将培养板置于培养箱中，并每隔2-3天用MSCGM培养基换液。

对后续传代重复此操作。在扩增细胞群体时，记录传代次数。间充质干细胞将在第4至8代之间使用。

4. 细胞在胶原蛋白/纤连蛋白/纤维蛋白原溶液中的重悬（第0天）

实验前，请确保培养物中有足够数量的内皮集落形成细胞（ECFCs）和间充质干细胞（MSCs）；每个植入物和每只小鼠需要 0.8×10⁶ 个 ECFCs 和 1.2×10⁶ 个 MSCs。

1. 吸出每块培养板中的培养基，用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。去除 PBS 后，向每块 100-mm 培养板中加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。轻轻摇动培养板，使胰蛋白酶-EDTA 溶液均匀分布。置于 3–5 分钟。轻轻敲击培养板，在倒置显微镜下观察悬浮的脱落细胞。
2. 当细胞完全脱落时，加入 8 mL DMEM 培养基，将细胞悬液收集至 15-mL 圆锥形离心管中。取 10 μL 样品，用血细胞计数板计数，计算所收获的 ECFCs 和 MSCs 的总数量。
3. 将 4×10⁶ 个 ECFCs（5×0.8×10⁶ 个细胞）和 6×10⁶ 个 MPCs（5×1.2×10⁶ 个细胞）共同转移至一个 50-mL 圆锥形离心管中。此为五个独立植入物及五只小鼠所需的总细胞量。以 1200 rpm 离心，弃去上清液。
4. 轻轻将 100 μL 纤维蛋白原溶液加入 0.9 mL 胶原蛋白/纤连蛋白溶液中（最终纤维蛋白原浓度为 3 mg/mL）；将混合物置于冰上保存。
5. 用 1 mL 冰冷的胶原蛋白/纤连蛋白/纤维蛋白原溶液重悬细胞沉淀；非常轻柔地混匀，避免产生气泡。将混合液装入一支 1-mL 无菌注射器中，并在注射器尖端安装带帽的 26 号针头。将装有混合液的注射器置于冰上，直至注射使用。

5. 免疫缺陷裸鼠注射（第0天）

所有动物实验将使用6周龄的裸鼠（athymic nude，nu/nu）进行。

1. 注射前，将免疫缺陷小鼠放入输送异氟烷的麻醉舱中进行麻醉。让小鼠吸入异氟烷约2分钟，直至其完全麻醉且对脚趾夹捏无反应（通过观察其心跳情况进行监测）。
2. 对每只小鼠，使用26号针头在背部上区皮下注射50 μL凝血酶溶液（10 U/mL）。
3. 在注射凝血酶的同一位置，使用26号针头注射200 μL细胞混合物。胶原蛋白在37°C下会凝胶化，而纤维蛋白原在凝血酶存在下会形成纤维蛋白凝胶。因此，植入物应在皮下形成一个虽小但可触及的隆起。
4. 注射后，将小鼠置于纱布层上以保持舒适和温暖，并持续观察直至其恢复自主活动。之后，在最初三天内每日观察小鼠一次。

6. 收获（第7天）

1. 注射后一周，将小鼠放入输送压缩 CO₂ 气体的安乐死舱内，实施安乐死。
2. 安乐死后，切开注射部位附近的皮肤，手术取出凝胶塞。建议对取出的凝胶塞连同标尺一并拍摄数码照片。
3. 将收获的凝胶塞放入组织学包埋盒中，并于室温下浸入 10% 中性缓冲甲醛溶液中固定过夜。
4. 固定完成后，用蒸馏 H₂O 洗去 10% 中性缓冲甲醛溶液，将组织学包埋盒置于 PBS 中，4°C 保存，直至进行组织学评估。

7. 评估：组织学（H&E）和免疫组织化学（hCD31）

1. 进行组织学评估时，将植入物包埋于石蜡中，并按照标准组织学程序切片（切片厚度为 7 μm）。
2. 通过分析取自植入物中部的苏木精-伊红（H&E）染色切片来定量微血管密度。H&E 染色的标准操作流程可参见其他文献。微血管可被识别为含有红细胞的管腔结构。微血管密度以所分析视野中含红细胞的微血管平均数量表示，单位为血管数/mm²。
3. 为证实微血管的人源性，应对回收的植入物切片采用人特异性 CD31（hCD31）抗体进行免疫组织化学染色，染色操作遵循标准流程。我们推荐使用 DakoCytomation 公司的单克隆小鼠抗人 CD31 抗体（克隆号 JC70A；货号 # M0823），稀释比例为 1:100。该抗体的人特异性已通过多种小鼠组织切片的平行染色结果得到验证，后者均呈阴性反应^7,11。需要注意的是，小鼠血管常出现在植入物内部（尤其在边缘区域），但该抗体不会与小鼠血管发生阳性染色。此外，可通过针对人特异性 CD90 或 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的抗体免疫组织化学染色来检测人源间充质干细胞（MSC）的存在。人源 MSC 可分布于新生血管的血管周围区域，也可散在分布于植入物的间质中¹¹。

8. 代表性结果

图1. ECFC和MSC培养物的典型形态。相差显微图像显示了体外培养的ECFC和MSC的典型形态。（A）来自脐血的ECFC形成融合的单层，呈现内皮细胞特征性的鹅卵石样形态。（B）人骨髓来源的MSC呈现纺锤形形态。比例尺：200 µm。

图2. 移植7天后取出的凝胶块外观。如文中所述，将人脐带血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）和骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）包埋于胶原蛋白/纤连蛋白/纤维蛋白凝胶中，并皮下植入裸鼠体内。（A）7天后，在处死小鼠后，剪开注射部位附近的皮肤，翻起皮肤以暴露细胞/凝胶块。（B）从动物体内手术取出、尚未经福尔马林固定的凝胶块外观。植入物呈现红色，提示已发生血管化。

图 3. 移植取出物中血管网络的组织学鉴定。取自取出物中间部分的苏木精和伊红（H&E）染色切片。（A）低倍镜（10×）显微图像，显示植入物（由黄色虚线标记）及其周围宿主组织（即脂肪组织和骨骼肌）的整体结构。（B）高倍镜（40×）显微图像，显示植入物内部多个微血管（黄色箭头指向其中部分微血管）；微血管可被识别为含有红细胞的管腔样结构。

图 4. 人源管腔的免疫组织化学鉴定。 取自移植后取出的凝胶塞中间部分的免疫组织化学染色切片。染色使用 DakoCytomation 公司生产的单克隆小鼠抗人 CD31（hCD31）抗体（克隆号 JC70A；货号 M0823），稀释比例为 1:100；细胞核采用苏木精复染。（A）低倍镜（10×）显微图像，显示植入物（由黑色虚线标出）及其周围宿主组织的整体情况。特异性人源 CD31 阳性微血管呈棕色（过氧化物酶染色）。（B）高倍镜（40×）显微图像，显示凝胶塞内存在多个人源微血管（黑色箭头指示部分 hCD31 阳性管腔）。

讨论

这是一种生物工程化人源血管网络的实验模型。该模型的主要特征包括：1）微血管由来自出生后组织（即血液和骨髓）的人源细胞形成；2）微血管在成年动物体内形成；3）微血管并非来源于已存在的（宿主）血管，而是由悬浮在适宜凝胶中的单个细胞从头（de novo）形成。

血管生成在该实验中起着重要作用，因为需要与小鼠的脉管系统建立连接，以形成充满红细胞的血管，这是本实验的功能性检测指标之一。此外，移植后的早期阶段会募集宿主的髓系细胞至植入物中，这些细胞对于新生血管床的形成是必需的 ¹²。

该实验模型提供了一个多功能、可量化且相对简单的体系，用于在活体（in vivo）条件下研究人类血管网络的出生后形成过程。此外，该检测方法操作简便，无需进行切口或外科手术。该模型可用于评估不同来源的人内皮细胞和血管周围细胞的血管发生潜能。该模型还可用于筛选具有抗血管发生和/或促血管发生活性的化合物。最后，该模型可用于研究特定基因在由人内皮构成的血管网络形成与功能中的作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
内皮细胞基础培养基 EBM-2	Lonza Inc.	CC-3156
EGM-2 SingleQuot 添加剂	Lonza Inc.	CC-3162
谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液，100 倍浓缩 GPS	Mediatech, Inc.	30-009-CI
间充质干细胞生长培养基 BulletKit，MSCBM/MSCGM	Lonza Inc.	PT-3001
高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基，1 倍 DMEM	Invitrogen	11995-073
MEM 非必需氨基酸溶液，100 倍浓缩 NEAA	Invitrogen	11140-050
高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基，粉末状 DMEM	Invitrogen	12100-046
HEPES 缓冲液	Invitrogen	15630-080
Cultrex 牛 I 型胶原蛋白溶液	Trevigen Inc.	3442-050-01
Cultrex 人纤维连接蛋白	Trevigen Inc.	3420-001-01
牛血浆来源纤维蛋白原	Sigma-Aldrich	F8630-1G
明胶	Fisher Scientific	DF0143-17-9
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液，PBS	Invitrogen	14190-250
胰蛋白酶-EDTA 溶液，1 倍	Invitrogen	25300-054
异氟烷，吸入用液体	Buxter Healthcare Corporation	NDC 10019-360-40
牛血浆来源凝血酶	Sigma-Aldrich	T4648-1KU
中性缓冲福尔马林溶液	Sigma-Aldrich	HT501128
单克隆小鼠抗人 CD31 抗体	Dako	M0823	克隆号 JC70A