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粉末样品绝对量子产率测量

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DOI：

10.3791/3066

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2012年5月12日

1Marketing and Applications, Hitachi High Technologies America

本文内容

摘要

在本视频中，我们将演示如何使用日立F-7000量子产率测量系统，直接对粉末样品进行绝对量子产率和色度坐标测量与计算。

摘要

荧光量子产率的测量已成为照明、音视频设备、有机EL材料、薄膜、滤光片以及生物工业用荧光探针的研发、评估、质量控制和研究中寻找新解决方案的重要工具。

量子产率是通过材料吸收的光子数与发射的光子数之比来计算的。量子产率越高，荧光材料的效率越好。

本视频中介绍的测量将使用配备量子产率测量附件和报告生成程序的Hitachi F-7000荧光分光光度计。所提供的所有信息均适用于该系统。

粉末样品中量子产率的测量按以下步骤进行：

  1. 生成激发和发射单色仪的仪器校正因子。这是准确测量量子产率的重要前提。该步骤已在仪器的全测量范围内预先完成，由于时间限制，本视频中将不展示此过程。
  2. 测量积分球校正因子。此步骤的目的是考虑用于测量的积分球自身的反射特性。
  3. 使用直接激发和间接激发进行参比样品和待测样品的测量。
  4. 利用直接激发和间接激发计算量子产率。直接激发是指样品直接面对激发光束的情况，属于常规测量设置。然而，由于我们使用积分球，样品荧光产生的部分发射光子会被积分球内壁反射并再次激发样品，因此必须考虑间接激发的影响。这一影响通过将样品置于面向发射单色仪的端口进行测量，计算间接量子产率，并对直接量子产率结果进行校正来实现。
  5. 校正后的量子产率计算。
  6. 使用报告生成程序（Report Generator）计算色度坐标。

日立F-7000量子产率测量系统在本应用中具有以下优势：

  • 高灵敏度（信噪比 RMS 达 800 或更高）。信号是指在以下条件下测得的水的拉曼谱带：激发波长 350 nm，激发和发射带宽均为 5 nm，响应时间 2 秒）；噪声是在拉曼峰最大值处测得。高灵敏度使得即使量子产率很低的样品也能进行测量。使用该系统，我们测得水杨酸样品的量子产率低至 0.1，钨酸镁样品的量子产率高达 0.8。
  • 测量精度高，动态范围达六个数量级，可在相同条件下同时测量高强度的尖锐散射峰和低强度的宽荧光峰。
  • 由于扫描速度高达 60,000 nm/分钟并具备自动快门功能，实现了高测量通量并减少了样品的光照暴露。
  • 可在 240 至 800 nm 的宽波长范围内测量量子产率。
  • 准确的量子产率测量结果得益于在测量样品前采集仪器的光谱响应和积分球校正因子。
  • 专用且易于使用的软件提供多种可计算参数。

在本视频中，我们将测量粉末状水杨酸钠的量子产率，其已知量子产率值为 0.4 至 0.5。

方案

1. 系统配置

  1. 配备高灵敏度扩展范围光电倍增管 R-928F 检测器的 F-7000 荧光分光光度计。
  2. F-7000 配件：使用罗丹明 B、光扩散器、红色滤光片和次级标准光源来生成仪器的光谱校正因子。
  3. 量子产率测量附件，包括：60 mm 积分球、氧化铝白板、Spectralon 白色标准、粉末样品池（2 个）、氧化铝粉末及量子产率软件。
  4. 使用报告生成程序及相应模板计算色度坐标。

2. 系统设置

  1. 打开日立F-7000荧光分光光度计，让氙灯预热一小时。使用仪器中安装的标准样品室（比色皿 holder）。

3. 积分球校正因子的获取

在测量积分球校正因子时，软件会自动选择表1中列出的测试参数。

分析条件
测量模式波长扫描
扫描模式同步扫描
数据模式荧光
发射波长 (EM WL)200 nm
激发起始波长 (EX Start WL)200 nm
激发终止波长 (EX End WL)900 nm
扫描速度240 nm/min
延迟时间5.0 s
激发狭缝 (EX Slit)5.0 nm
发射狭缝 (EM Slit)20 nm
光电倍增管电压 (PMT Voltage)250 V
校正光谱开启
响应模式自动

表1.

3.1. 扩散器数据的获取

  1. 将漫射器放入标准样品室中，并关闭样品室。
  2. 点击“量子产率校正因子测量”窗口，然后选择“漫射器测量”。
  3. 输入文件名：“IS_factor_F70_diffuser”作为漫射器数据，并点击确定（视频 1）。
  4. 测量完成后，文件将保存在 FL Solutions 软件的“Correct”文件夹中。图 1 为漫射器测量数据的示例。

3.2. 获取无样品（参考）校正因子

  1. 从仪器上取下标准样品室，存放漫射器，然后安装积分球。
  2. 将氧化铝粉末填充至粉末样品室中，高度至少达到25 mm，以确保粉末完全覆盖积分球的通光孔。轻轻敲击样品室底部，使粉末压实。
  3. 将氧化铝白板放入积分球的参比端口（P2）（面向发射单色仪的端口），将装有氧化铝的粉末池放入积分球的样品端口（P1）（面向激发单色仪的端口）。
  4. 单击量子产率校正因子测量窗口，然后选择积分球测量（无样品）视频 2).
  5. 软件将提醒您设置样品。输入名称“无样本的IS并点击“确定”。
  6. 测量完成后，文件将保存在 FL Solutions 的“Correct”文件夹中。 图2 是未放置样品时积分球测量数据的一个示例。

3.3. 存在样品时校正因子的获取：

  1. 移除装有氧化铝粉末的样品室，换上Spectralon白色标准板。（Spectralon标准板应朝向激发单色器（P1）。）
  2. 单击量子产率校正因子测量窗口，然后选择积分球测量（含样品）。软件将提示您设置用于测量的标准反射材料。
  3. 输入名称：“样本中的 IS“选择带有样本数据文件的积分球，然后单击确定（视频 3).
  4. 测量完成后，文件将保存在 FL Solutions 的“Correct”文件夹中。 图3 是积分球及其样品测量数据的示例。

注意：如果需要使用截止滤光片来阻挡发射端的二级散射光（这些散射光会干扰荧光峰），则需要仅使用漫射器测量基线，同时使用漫射器和相应的滤光片进行测量。这些数据文件将在软件计算量子产率时被使用。在实际操作中，我们建议在系统初始设置阶段即完成所有截止滤光片的测量。

4. 样品测量（水杨酸钠粉末）

量子产率测量需要获取无样品（参比）和有样品情况下的发射光谱。分析测量参数选择如下：

  1. 点击“方法”按钮，在“常规”选项卡中选择波长扫描作为测量模式，并输入操作人员和附件的相关信息（视频 4）。
  2. 点击“仪器”选项卡，并按照表 2所示输入仪器的测量参数（视频 5）。
分析条件
测量波长扫描
扫描模式发射
数据模式荧光
EX WL350 nm
EM 起始波长330 nm
EM 结束波长600 nm
扫描速度1200 nm/min
延迟0 s
EX 狭缝5.0 nm
EM 狭缝5.0 nm
PMT 电压350 V
校正光谱开启
响应自动
校正光谱开启

表2.

  1. 目前无需进行其他设置，因为监测、处理和报告选项卡的设置可在数据测量完成后进行。我们只需查看这些设置，然后单击“确定”按钮，以将选定的测量参数设定在仪器中（视频 6）。
  2. 可选择将已设定的参数保存以供将来使用。接下来，我们将使用直接激发方式测量氧化铝参考标准样品。
  3. 将装有 Al2O3 粉末的粉末样品池放入样品测量端口（P1）（位于激发光束前方）。
  4. 单击“样品”按钮，并输入样品名称：“P1_Baseline_Al2O3”，然后勾选“自动保存文件”选项旁的复选框。选择数据保存的文件夹及文件名：“P1_Baseline_Al2O3”，然后单击“保存”和“OK”按钮（视频 7）。
  5. 单击“测量”按钮以测量 Al2O3 样品（视频 8）。数据处理窗口打开后，单击“自动调整坐标轴”按钮以调整坐标尺度，从而观察直接激发下的散射峰（图 4）。
  6. 接下来，我们将使用直接激发方式测量水杨酸钠样品。单击“样品”图标，输入样品和文件名：“P1_Sodium Salicylate”，然后单击“OK”按钮（视频 9）。
  7. 将水杨酸钠样品装入粉末样品池，并放入积分球的 P1 端口（面向激发光束的端口），然后单击“测量”按钮（视频 10）。数据处理窗口打开后，单击“自动调整坐标轴”按钮以调整尺度，观察散射峰和荧光峰。
  8. 接下来，我们将把氧化铝和水杨酸钠样品移至积分球的 P2 端口进行重复测量，以实现间接激发下的读数。
  9. 首先单击“样品”按钮，并输入样品名和文件名：“P2_Baseline_Al2O3”（两者均使用该名称）（视频 11）。
  10. 将氧化铝白板从积分球的 P2 端口移至 P1 端口，并在 P2 端口放置一个装满氧化铝粉末的样品池。
  11. 单击“测量”按钮以读取样品（视频 12）。
  12. 为完成样品测量，需使用间接照射方式测量水杨酸钠样品。首先，按照之前的步骤输入样品名和文件名，名称为 P2_Sodium salicylate（视频 13）。
  13. 将水杨酸钠样品放入积分球的 P2 端口，然后单击“测量”按钮（视频 14）。

5. 量子产率计算

首先，我们将加载积分球校正因子。

  1. 单击量子产率计算按钮，以打开量子产率计算程序（视频 15).
  2. 单击量子产率校正因子设置按钮（视频 16).
  3. 单击积分球校正选项卡，勾选“积分球校正”前面的复选框，然后单击滤光片校正选项卡，确保“滤光片校正”复选框未被选中，再次单击积分球校正选项卡视频 17).
  4. 单击漫反射测量数据部分的加载按钮，然后选择文件“IS_factor_F70 无样本" (视频 18).
  5. 选择“IS因子F70扩散器文件，然后单击加载按钮（视频 19).
  6. 单击积分球测量数据（无样品）部分的加载按钮（视频 20).
  7. 选择“IS_factor_F70 无样本文件，然后单击加载按钮（视频 21).
  8. 单击积分球测量数据（含样品）部分的加载按钮（视频 22).
  9. 选择“IS_factor_F70 与样本文件，然后点击加载按钮（视频 23).
  10. 归一化波长可保持在600 nm，或调整至积分球校正等于1的波长值。为此，请确保选中“显示量子产率计算窗口”前面的复选框，然后点击“量子产率因子设置”窗口中的“确定”按钮，该操作将关闭此窗口视频 24).
  11. 现在点击“量子产率计算”窗口中的“积分球校正”选项卡，调整光标直至积分球校正读数为“1”，并记录下该波长（视频 25).
  12. 点击“量子产率校正因子设置“并根据需要将归一化波长更改为上一步骤中获得的读数，然后单击确定按钮（视频 26).

下一步是加载基线和样本数据文件

  1. 点击“量子产率计算”标签（视频 27）。
  2. 通过点击加载按钮，为直接照射加载“无样品数据”（文件 P1_Baseline_Al2O3），并加载“有样品数据”（文件 P1_Sodium salicylate）以进行直接照射（视频 28）。
  3. 接下来，我们将选择“散射”和“荧光”区域（视频 29）。
  4. 现在我们将计算样品在直接照射下的量子产率。点击“计算”按钮并读取结果（视频 30）。该数据将在最终计算考虑间接激发的样品量子产率时使用。
  5. 点击文本文件并以“QY Direct Irradiation”为文件名保存数据（视频 31）。
  6. 使用数据文件 P2_Baseline_Al2O3 和 P2_Sodium salicylate，我们将计算间接激发下的量子产率（视频 32）。现在我们将保存此数据，用于最终的量子产率计算。
  7. 点击文本文件，并将数据文本文件保存为“QY Indirect Irradiation”（视频 33）。现在我们将在 Excel 中打开这两个包含直接和间接激发量子产率数据的文本文件。最后，我们将使用以下公式计算包含间接激发效应的样品量子产率：

Φ=Φd-(1-Ad)ΦI

其中：

Φ 是考虑了间接激发后的校正量子产率

Φd 是采用直接激发法测定的内量子产率。（内量子产率 = 荧光量 / 吸收的激发光量。）

Ad 是直接激发的吸收率。（此值为样品吸收的激发光束量之比。)（吸光度 = (ArEx - CsEx) / ArEx，其中 ArEx 为激发光量，CsEx 为反射光量）

ΦI 是采用间接激发的内量子产率

Φ=0.536 - (1 - 0.848)0.420 计算得出
Φ=0.47216

6. 色度的计算

  1. 我们将使用可选的软件“报告生成器”（Report Generator），并结合为色度计算准备的模板进行操作。
  2. 打开数据文件 P1_Sodium salicylate（视频 34）。
  3. 点击“属性”按钮，然后选择“报告”选项卡。在“输出”下拉菜单中选择“使用打印生成器表格”。在“打印项目”中选择模板“FL70Std01_Color-chart.xls”，然后点击“打开”按钮。无需手动选择波长范围和间隔，因为报告生成器将自动完成此操作（视频 35）。
  4. 下一步是生成报告。点击“报告”选项卡，系统将执行生成报告的宏，并以样品名称命名，保存为 Excel 格式，存储在“Reports”文件夹中（视频 36）。
  5. 此时，我们可以打开报告以查看颜色数据（视频 37）。

7. 成功的秘诀

  1. 使用新鲜样品。
  2. 请注意，不同制造商提供的材料可能会产生不同的结果。
  3. 轻敲粉末样品池底部，以压实样品并提供均匀的测量表面。
  4. 避免样品暴露于光线下。光照会导致样品降解。
  5. 尝试使用更快的扫描速度，以尽量减少样品暴露于光下的时间。

8. 代表性结果

8.1. 已知水杨酸钠的量子产率为 0.4 至 0.5

漫反射光谱、图表、纳米尺度、吸收分析、光学研究结果。
图 1. 点击此处查看大图。

积分球数据，图表；光谱测量，纳米尺度；光学分析，发射光谱。
图 2. 点击此处查看大图。

积分球数据图，光谱分析范围200-900 nm，光学光谱测量。
图3. 点击此处查看大图。

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披露

Luis A. Moreno 供职于生产本文所用仪器的 Hitachi High Technologies America 公司。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
水杨酸钠粉末Wako Pure Chemical Industries, Ltd.191-03142分子量 160.10

参考文献

  1. Quantum Yield Measurement of Sodium Salicylate. FL080002, Hitachi High Technologies Corporation. 1(2008).
  2. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Science and Business Media, LLC. 60, Springer. New York, N.Y. (2006).
  3. Horigome, J., Wakui, T., Shirasaki, T. A Simple Correction Method for Determination of Absolute Fluorescence Quantum Yields of Solid Samples with a conventional Fluorescence Spectrophotometer. Bunseki Kagako. 58 (6), 553-559 (2009).

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