一种用于小鼠可控性Helicobacter感染的经口胃内灌胃技术

摘要

来源：D'Costa, K. 等 小鼠模型 幽门螺杆菌 感染与胃部病理学 视频实验杂志 (2018)

本视频展示了建立 幽门螺杆菌 通过灌胃法在小鼠模型中建立感染。将细菌悬液给予 通过 通过口腔插入胃内的导管。接种的细菌在胃内定植并建立感染，可用于研究宿主与病原体之间的相互作用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 细菌接种物的培养与制备

1. 解冻甘油菌种保藏管 幽门螺杆菌（H. pylori））或 H. felis 从-80 °C取出后，在含以下成分的马血琼脂（HBA）平板上进行传代培养：血液琼脂基础培养基No.2（见材料表）；改良的“Skirrow抗生素选择性补充剂”（含万古霉素10 μg/mL、多粘菌素B 25 ng/mL、甲氧苄啶5 µg/mL、两性霉素B 2.5 μg/mL）；以及5–10%（v/v）马血。细菌在37 °C、微需氧条件下，在含有适当气体包的2.5或3.5 L厌氧罐（见材料表）中生长良好。
   注意： H. pylori 在这些条件下培养的菌株必须在培养1–1.5天后进行转接培养，而 H. felis通常需要至少2天的孵育时间。合适的培养和保存培养基此前已有详细描述。
2. 从小至中期对数生长阶段的培养物中制备用于小鼠感染的细菌接种物。通过向每块琼脂平板加入1–2 mL脑心浸出液（BHI）肉汤，轻柔地冲洗平板以收获细菌。使用巴斯德吸管吸取平板上的菌悬液。
   1. 或者，从 幽门螺杆菌 在BHI肉汤中培养16–18小时的细菌。在此情况下，以2,200 x g的低速离心收集细菌 g 4 °C 下离心 10 分钟。
3. 通过相差显微镜（100倍物镜）观察湿片制备样品，评估细菌的活力与运动性。制备湿片时，用接种环取适量细菌，悬浮于载玻片上10–20 μL BHI肉汤液滴中。对于 H. felis，其大小远超 H. pylori使用血细胞计数板准确定量活菌数量。通过革兰染色确认培养物的纯度。
   注意： 仅使用 H. pylori 若大多数细菌呈杆菌状或螺旋状（形态可能因菌株而异）。 H. felis 接种物应主要包含螺旋形细菌. 如果大多数细菌呈球状形态，则不要使用该接种物，因为这种形态的细菌不可行，无法在小鼠体内建立感染。
4. 通过相差显微镜计数接种物中的细菌数量：在100倍物镜下观察每个视野中的细菌大致数量，并参照以下标准进行估算：每个视野1个细菌 ≈ 约10个细菌⁶ 菌落形成单位（CFU）的 幽门螺杆菌/mL；每视野10个细菌 = 约10⁷ CFU/mL；每视野100个细菌 ≈ 约10⁸ CFU/mL 等等。
   1. 使用血细胞计数板时，按以下公式计算CFU/mL：
      CFU/mL =（4 × 4 视野中细菌平均数量）×（稀释倍数）×（10⁴).
5. 将接种物的细菌细胞密度调整至约10⁷–10⁸ 必要时，用BHI肉汤稀释后测定CFU/mL。
   1. 为确保细菌活性最大化，应在制备完成后尽快使用灌胃接种物。
   2. 务必确认 H. pylori 通过在灌胃操作后立即对接种物进行活菌计数，测定细胞密度和存活率（见下文）。这并非在所有情况下均可行 H. felis，因为它通常不会在培养基上形成孤立的菌落。活菌数量 幽门螺杆菌接种物中的细胞数量无法通过光密度测量（A₆₀₀）单独使用，因为该方法无法区分活细胞（即，杆菌/螺旋体/螺旋状）和非活性（即， 球状细菌
   3. 使用光密度值作为估算活菌数量的方法 H. pylori 接种物中的细菌，但在此情况下，首先需要绘制一条生长曲线。为此，需测定A₆₀₀ 值 H. pylori 通过平板计数法测定活菌数量，并随时间监测培养物，将其结果与活菌数直接关联。
      注意： 进行此类生长曲线测定的一种便捷方法是将细菌接种于液体培养基中（第1.2节），使用标准的平底组织培养瓶，并置于含10% CO₂的培养箱中培养。₂ 培养箱。随后，通过每4–6小时采集一次培养物等分试样，持续2–3天，测定菌落形成单位（CFU）数量，并与相应的A值进行比较₆₀₀ 值。重要的是，必须为每种情况生成生长曲线 H. pylori 菌株，因为它们的生长速率可能不同，此外，并非所有菌株均能在10% CO₂条件下良好生长₂.

2. 采用灌胃法对小鼠给予Helicobacter

注意：该经口胃内灌胃方法可应用于其他定植肠道的细菌种类，例如 S. Typhimurium、C. rodentium、Listeria monocytogenes。

1. 使用6–8周龄、无特定病原体（SPF）且无螺杆菌（Helicobacter）的雄性或雌性小鼠。进行幽门螺杆菌（H. pylori）或猫螺杆菌（H. felis）感染实验时，应使用C57BL/6遗传背景的小鼠。在本研究中，我们使用了野生型（WT）以及缺乏关键天然免疫受体的基因修饰C57BL/6小鼠（称为基因敲除或KO小鼠）。
   注意：其他遗传背景的小鼠也可用于螺杆菌（Helicobacter）感染，但定植水平和疾病严重程度可能受宿主遗传背景类型的影响。
2. 将细菌接种物（步骤1.5）吸入一次性1 mL注射器中，并将原配针头更换为23号针头，其上连接一次性聚乙烯导管（长度6–8 cm，内径0.58 mm）。用小条塑料薄膜将导管固定在针头上（参见材料表）。或者，可使用无菌塑料饲喂管（20号 × 38 mm）替代针头/导管组件。
3. 用手牢固抓住小鼠颈部皮肤和尾巴，对其进行物理固定。
   注意：该操作可在无麻醉条件下进行，也可选择使用吸入麻醉剂，如甲氧氟烷或异氟烷。
4. 将导管插入张开的口腔中央，并向尾侧方向引导至食管。伸展小鼠颈部，以便经食管顺利进入胃部（避开气管），直至导管大部分或全部不可见并感到阻力，表示已到达胃底部。注入特定体积的接种液，通常每次接种100 μL （图1）。
   注意：为确保最佳定植和疾病病理表现，小鼠灌胃剂量应不少于10⁵ CFU。

结果

图1：展示口服灌胃技术的示意图。 一次性1 mL注射器和软质导管用于输送≥10⁵ 小鼠细菌接种物的菌落形成单位（CFU） 通过 经胃内途径。使用甲氧氟烷麻醉小鼠，并牢固握住其颈部，以便导管进入胃部 通过 食管

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌学试剂
Oxoid Blood Agar Base No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	使用前溶于去离子水中，再进行灭菌
Premium Defibrinated Horse blood	Australian Ethical Biologicals	PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth	BD Bioscience	237500	使用前溶于去离子水中，再进行灭菌
CampyGen gas packs	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
其他试剂
Methoxyflurane (Pentrhox)	Medical Developments International	不适用
仪器与塑料耗材
Oxoid Anaerobic Jars	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes	Interpath Services	200CS01
Eppendorf 5810R 离心机			在 4°C 条件下以 2,200 rpm 离心 10 分钟，收集菌体沉淀
23g precision glide 针头	BD Bioscience	301805
Parafilm M	Bemis, VWR	PM996
Portex 细孔聚乙烯导管	Smiths Medical	800/100/200
塑料喂养导管	Instech Laboratories	FTP20-30
1 ml 结核菌素鲁尔滑动一次性注射器	BD Bioscience	302100
适用于 1.2 - 2 mL 管的 Eppendorf 微型研磨棒	Sigma Aldrich	Z317314	可高压灭菌的聚丙烯研磨棒，用于胃组织匀浆
无菌塑料接种环	LabServ	LBSLP7202