本文描述了一种通过沃顿氏管（Wharton's duct）插管小鼠下颌下唾液腺的实验方案。在本实验中，使用台盼蓝溶液作为示踪染料，以证明该技术能够有效地将灌注液输送至靶向腺体，并提示这一新方法作为唾液腺再生潜在临床药物/细胞治疗手段的可靠性。
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本文内容
摘要
摘要
严重的唾液腺功能低下常发生于干燥综合征患者以及因癌症治疗而接受头颈部放射治疗的患者中。这两类患者均会出现口干、吞咽困难（咀嚼和吞咽功能受损）、严重龋齿、味觉改变、口咽部感染（如念珠菌病）、黏膜炎、疼痛和不适等症状。
再生医学中一种治疗唾液腺功能减退的创新方法在 RS Redman、E Mezey 的研究中被推测 等 2009年：通过插管将干细胞直接注入腺体，是一种恢复受损器官功能的有效方法。推测移植的外源性干细胞将分化为腺体细胞，作为宿主唾液腺的一部分发挥功能。此外，该插管技术也是临床基因转导应用中一种便捷且高效的递送方法。
本文展示了通过沃顿管（Wharton's duct）对小鼠下颌下唾液腺进行插管操作的步骤（图1）。本实验使用C3H小鼠（Charles River，加拿大魁北克省蒙特利尔市），饲养于麦吉尔大学动物资源中心的清洁常规环境中。所有实验均经大学动物护理委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会的指导原则。
在本实验中，使用套有聚乙烯管的29号针头胰岛素注射器，通过沃顿管（Wharton's duct）的开口将台盼蓝溶液注入腺体。随后解剖小鼠，以显示灌注液已成功进入腺体。
方案
1. 操作步骤描述
- 每只小鼠皮下注射 1 μl/g 体重的 0.5 mg/ml 硫酸阿托品一水合物（Cat# 11330, Fluka, USA），以防止唾液分泌干扰灌注液的流动。
- 用氯胺酮（100 mg/ml）和赛拉嗪（20 mg/ml）混合溶液（Phoenix Scientific，AR，美国）对每只小鼠进行麻醉，剂量为每克体重1 μl，注射给药 腹腔内 (I.P.)
- 将小鼠置于定制的塑料平台上，呈腹侧卧位：用金属丝固定上颌门齿，下颌门齿钩挂于弹性细绳上，以保持口腔张开。
- 使用带有29号针头的胰岛素注射器（产品编号：600145，Tyco Healthcare，MA，USA），将其置于外径为0.58 mm的聚乙烯管内（产品编号：427410，Becton Dickinson，MD，USA）； 图 2将聚乙烯管插入29号针头尖端上方5 mm处。使用针头作为刚性引导，将聚乙烯管送入沃顿管（Wharton's duct）。聚乙烯管插入导管内3–5 mm。注意仅聚乙烯管进入唾液腺导管，而针头保持在导管外。通过位于舌下下方的沃顿管，向下颌下腺注入50 μl过滤后的0.4%台盼蓝染色液（Cat# 15250, Gibco, USA）。注射时以恒定正压推动注射器活塞，匀速输注；即使在全部液体注入腺体后，手指仍需保持在活塞上，以防止液体自口腔内反流。视频中使用台盼蓝溶液作为染料以展示该技术。
- 注射台盼蓝溶液后，对小鼠实施安乐死，然后进行解剖。通过手术暴露唾液腺，以确定注入的溶液实际保留在腺体中的量。
2. 典型结果：
注射灌注液后，解剖小鼠以手术暴露插管后的唾液腺。如图2所示，沃顿管（Wharton's duct）呈现深色，表明台盼蓝溶液已成功灌注。
图1. 小鼠下颌下腺插管术。
图2. 聚乙烯管包裹在29号针头的尖端。注射器针头用作刚性导引，将聚乙烯管插入沃顿氏管（Wharton's duct）。聚乙烯管插入（插管）导管内3-5 mm。注意，仅聚乙烯管进入唾液腺导管，而针头保留在导管外。
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讨论
使用该插管方法的一个难点是防止注入溶液的回流。即使台盼蓝溶液已暂时成功进入唾液腺，唾液分泌仍可能干扰灌注过程，导致台盼蓝溶液从腺体中回流出来。作为预防措施，除了使用阿托品抑制唾液分泌外，在完成灌注后，聚乙烯导管应继续保持在下颌下腺导管（Wharton's duct）内，并将注射器活塞维持推注状态60秒。这将使大部分灌注溶液保留在腺体内。
传统上，全身给药，即静脉注射（I.V.）药物/细胞，已被用作唾液腺再生的临床方法。静脉注射的输注物会流经整个循环系统，仅有少量药物/细胞能够迁移至靶向腺体。与这种传统方法相比，局部给药，即通过插管术注射药物/细胞，可被视为一种更直接且更有效恢复腮腺、下颌下腺和舌下腺功能的方法。因此，该插管技术可作为小鼠唾液腺再生医学的一种可靠模型；并且从未来前景来看，该操作可能成为临床应用的一种便捷方法。
本视频文章若能作为对唾液腺再生医学领域进一步研究感兴趣的学生和研究人员的有效工具，将不胜荣幸。
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披露
所有实验均已获得大学动物护理委员会的批准，并符合加拿大动物护理委员会的指南。
致谢
作者感谢安娜·科特里姆博士（Dr. Ana Cotrim）提供的技术咨询，以及蒙祖尔·默舍德博士（Dr. Monzur Murshed）提供的设备支持。本工作部分由加拿大卫生研究院资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 阿托品 | 药物 | Fluka | 11330 | 用于抑制唾液分泌 |
| 氯胺酮 | 药物 | Phoenix Scientific | 镇静 | |
| 赛拉嗪 | 药物 | Phoenix Scientific | ||
| 聚乙烯导管（0.58 mm 直径） | 导管 | Intramedic | 427410 | 套在针尖上以避免插入舌下腺管（Wharton’s duct）时造成组织损伤。 |
| 超舒适胰岛素注射器（带29G针头） | 注射器 | Tyco Healthcare, Covidien | 600145 | |
| 4% 台盼蓝 | 染料 | GIBCO, by Life Technologies | 15250 |
参考文献
- Fox, P. C. Acquired salivary dysfunction. Drugs and radiation. Ann N Y Acad Sci. 842, 132-137 (1998).
- Bhide, S. A., Miah, A. B., Harrington, K. J., Newbold, K. L., Nutting, C. M. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, prevention and treatment. Clin Oncol (R Coll Radiol). 21, 737-744 (2009).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotech Histochem. 84, 253-260 (2009).
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