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所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。
1. SPIO-MtbsAb 合成
- 使用先前报道的方法合成 SPIO 偶联的 2,2'-（乙烯二氧基）双乙胺 （EDBE）。
- 合成 SPIO-EDBE-琥珀酸酐 （SA）。
- 在室温下搅拌 SPIO-EDBE 和 SA 的碱性溶液（5 M NaOH;10 mL））（1 g;10 μmol）24 小时。
- 使用分子多孔膜管（12,000-14,000 MW 截止值）用 2 L 蒸馏水的 20 次变化透析溶液。每次变化 6 小时。
- 最后，将 100 μL SPIO-EDBE-SA（4 mg/mL Fe）添加到 400 μL 4.5 mg/mL 结核分枝杆菌表面抗体 （MtbsAb） 中，以 1-羟基苯并三唑和（苯并三唑-1-基氧基）三吡咯烷氧磷六氟磷酸盐为催化剂合成 SPIO-MtbsAb，并在室温下搅拌溶液 24 小时。
- 最后，通过凝胶过滤色谱将溶液从未结合的抗体中分离出来。
- 将反应混合物 （5 mL） 上样到 2.5 cm × 33 cm 色谱柱上，并使用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 缓冲液洗脱。使用二辛可宁酸蛋白测定试剂盒确认 Ab-纳米颗粒复合物（即纳米探针）。
2. 粒子形态观察和弛豫层测量
- 使用 100 kV 电压的透射电子显微镜检查平均粒径、形态和粒径分布。
- 将复合分散液滴铸到 200 目铜网格上，并在室温下风干，然后再将其加载到显微镜上。
- 使用 NMR 弛豫计在 20 MHz 和 37.0 °C ± 0.1 °C 下测量纳米探针的弛豫时间值（T1 和 T2）。
- 每次测量前校准松弛计。
- 分别记录通过反转恢复和 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 脉冲序列生成的八个数据点的 r1 和 r2 值，以确定 r1 和 r2 弛豫。
3. 细胞成像
- 在 RPMI 1640 中培养人单核细胞 THP-1，其中含有 10% 胎牛血清、50 μg/mL 硫酸庆大霉素、100 单位/mL 青霉素 G 钠、100 μg 硫酸链霉素和 0.25 μg/mL 真菌Zone，在 37 °C 的 5% CO2 培养箱中。
- 将 SPIO-MtbsAb 纳米探针 （2 mM） 与 106 个牛分枝杆菌 BCG 菌落形成单位 （CFU） 一起在 37 °C 的 5% CO 2 培养箱 （1 mL） 中与 1 ×10 7 个活化的单核细胞一起预孵育 1 小时。
- 以 200 x g 离心管并弃去上清液。将沉淀物重新溶解在培养基 （200 μL） 中。
- 使用快速梯度回波脉冲序列（重复时间 （TR） = 500;回波时间 （TE） = 20;翻转角 = 10°）来确定纳米探针的特异性和敏感性。
4. BCG（卡介苗）接种
- 在 Sauton 培养基中重构冻干疫苗或细菌原液，然后用生理盐水稀释原液，直至如前所述正确分散。
- 接种从 ADIMMUNE（台湾台北）（Connaught 菌株;如前所述，ImmuCyst Aventis， Pasteur Mérieux）以 0.1 mL/小鼠（即 107 CFU）的体积皮内注射到小鼠的左或右肩胛背皮肤中。将盐水注射到小鼠中作为阴性对照。接种 BCG 后每天监测动物。
- 使用二氧化碳安乐死在细菌接种后 1 个月处死动物。从皮内接种部位收获组织。将组织固定在 10% 福尔马林中，并将其包埋在 5-10 μm 的石蜡中，用于连续切片。用苏木精/伊红和 Ziehl-Neelsen 染色剂对抗酸细菌进行染色，用柏林蓝对三价铁进行染色。
5. 体内磁共振
成像
- 将氯胺酮（80 mg/kg 体重）和甲苯噻嗪（12 mg/kg 体重）皮下注射到小鼠体内进行动物麻醉。
- 将 SPIO-TbsAb 探针 （2 nmol/200 μL） 注射到小鼠的尾静脉中。探针注射前后立即对小鼠进行 MR 成像，然后每 5 分钟一次，持续 30 分钟，以获取 T2 加权快速自旋回波图像 （TR = 3000;TE = 90;视野 = 8）。
- 使用信号强度 （SI） 定量分析所有 MR 图像，SI 是对 Mtb 肉芽肿中心和与肉芽肿区域相邻的背部肌肉的可比位置的定义感兴趣区域的测量。
- 使用公式
在注射造影剂之前（SIpre;对照）和注射造影剂后 0-3 小时使用 SI 测量值计算相对信号增强
[（SIpost - SIpre）/SIpre] × 100
其中 SIpre 是增强前扫描中病变的 SI，SIpost 是增强后扫描中病变的 SI。