一种通过超顺磁性纳米探针检测肺外结核病的技术

摘要

来源：Lee, C., 等 超顺磁性氧化铁纳米探针的合成、表征及其在肺外结核检测中的应用。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种用于检测肺外结核病的技术。将偶联了针对Mycobacterium特异性抗体的超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米探针注射到先前感染了Mycobacterium bovis BCG的小鼠体内，可标记肉芽肿，从而提高成像对比度，更利于其检测。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. SPIO-MtbsAb 的合成

1. 采用已报道的方法合成SPIO偶联的2,2'-(亚乙基二氧基)双乙胺（EDBE）。
2. 合成SPIO-EDBE-丁二酸酐（SA）。
   1. 在室温下搅拌SPIO-EDBE和SA（1 g；10 µmol）的碱性溶液（5 M NaOH；10 mL）24小时。
   2. 使用截留分子量为12,000–14,000的透析膜管，将溶液在2 L蒸馏水中透析，共更换20次蒸馏水，每次6小时。
3. 最后，向400 μL浓度为4.5 mg/mL的溶液中加入100 μL SPIO-EDBE-SA（含铁4 mg/mL）。 结核分枝杆菌 表面抗体（MtbsAb）在1-羟基苯并三唑和（苯并三唑-1-氧基）三吡咯啉基磷六氟磷酸盐作为催化剂的条件下，与SPIO反应合成SPIO-MtbsAb，并在室温下搅拌反应24小时。
4. 最后，通过凝胶过滤色谱法将溶液与未结合的抗体分离开。
5. 将反应混合物（5 mL）上样至尺寸为2.5 cm × 33 cm的层析柱中，使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液进行洗脱。利用二辛可宁酸蛋白检测试剂盒确认抗体–纳米颗粒复合物（即纳米探针）。

2. 颗粒形貌观察与松弛层级测量

1. 使用透射电子显微镜在100 kV电压下检测平均粒径、形貌及粒径分布。
   1. 将复合分散液滴加到200目铜网上，室温下自然干燥后装入显微镜中。
2. 使用核磁共振弛豫仪在20 MHz和37.0 °C ± 0.1 °C条件下测定纳米探针的弛豫时间值（T1 和 T2）。
   1. 每次测量前对弛豫仪进行校准。
   2. 分别通过反转恢复法和卡尔-珀塞尔-梅博姆-吉尔脉冲序列获得八个数据点，并据此计算 r1 和 r2 值，以确定 r1 和 r2 弛豫率。

3. 细胞成像

1. 在含10%胎牛血清、50 µg/mL硫酸庆大霉素、100单位/mL青霉素G钠、100 µg硫酸链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B的RPMI 1640培养基中培养人单核细胞THP-1，置于5% CO₂培养箱中₂ 37 °C 培养箱中孵育。
2. 孵育SPIO-MtbsAb纳米探针（2 mM）与106个菌落形成单位（CFU）的 Mycobacterium bovis BCG 与 1 × 10 预孵育⁷ 在37 °C、5% CO2培养箱中，将活化的单核细胞置于微量离心管（1 mL）中孵育1小时。
3. 200 × g 离心管 g 弃去上清液，将沉淀物重新溶解于培养基中（200 µL）。
4. 使用3.0-T MRI，通过快速梯度回波脉冲序列（重复时间（TR）= 500；回波时间（TE）= 20；翻转角 = 10°）扫描样本，以确定纳米探针的特异性和灵敏度。

4. 卡介苗（Bacillus Calmette–Guérin）接种

1. 将冻干的疫苗或细菌储备液在Sauton培养基中重悬，然后用生理盐水稀释，直至均匀分散，具体方法如前所述。
2. 将来源于ADIMMUNE（中国台湾台北）的减毒活疫苗株M. bovis BCG（Connaught株；ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux），以每只小鼠0.1 mL（即10⁷ CFU）的剂量，经皮内注射至小鼠左侧或右侧背部肩胛区皮肤，操作方法如前所述。以生理盐水注射小鼠作为阴性对照。BCG接种后每日观察动物状态。
3. 细菌接种后1个月，采用二氧化碳安乐死法处死动物。采集皮内接种部位的组织样本，用10%福尔马林固定，包埋于石蜡中，并切成5–10 µm的连续切片。使用苏木精/伊红染色和抗酸染色（Ziehl-Neelsen法）检测抗酸菌，同时采用柏林蓝染色法检测三价铁离子。

5. 体内 MRI

1. 对小鼠皮下注射氯胺酮（80 mg/kg 体重）和赛拉嗪（12 mg/kg 体重）以进行动物麻醉。
2. 经尾静脉向小鼠注射 SPIO-TbsAb 探针（2 nmol/200 µL）。在注射探针前、注射后即刻以及此后每 5 分钟进行一次磁共振成像，持续 30 分钟，以获取 T2 加权快速自旋回波图像（TR = 3000；TE = 90；视野 = 8）。
3. 使用信号强度（SI）对所有磁共振图像进行定量分析，SI 为在结核分枝杆菌肉芽肿中心及邻近肉芽肿区域的背部肌肉中，位置可比的感兴趣区域的测量值。
4. 利用注射前（SIpre；对照）和注射造影剂后 0–3 小时（SIpost）的 SI 测量值，按以下公式计算相对信号增强度：
   [(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
   其中 SIpre 为增强前扫描中病灶的 SI，SIpost 为增强后扫描中病灶的 SI。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷基磷六氟磷酸盐	Sigma-Aldrich
1-羟基苯并三唑	Sigma-Aldrich
表氯醇，2,2'-(亚乙基二氧基)双(乙胺)	Sigma-Aldrich
人单核细胞 THP-1
M. bovis BCG	Pasteur Mérieux	Connaught 菌株；ImmuCyst Aventis
MRI	GE medical Systems	3.0-T, Signa
NMR 驰豫仪	Bruker	NMS-120 Minispec
SPECTRUM 分子多孔膜管，截留分子量 12,000–14,000	Spectrum Laboratories Inc
结核病表面抗体—抗结核分枝杆菌多克隆抗体	Acris Antibodies GmbH	BP2027
透射电子显微镜	JEOL	JEM-2000 EX II