大鼠肠系膜血管生成实验

摘要

用于研究以下两方面的正常成年哺乳动物血管化组织：该组织不具有生理性血管生成，且未接受过外科干预；（i）在腹腔内给予试验物质后，血管生成的启动与发展过程；（ii）在系统性给予选定试验物质后，对血管生成的调控作用。

摘要

成年大鼠肠系膜窗血管生成实验在生物学上具有合理性，且特别适用于出芽型血管生成的研究 体内 [参见综述性论文]，这是人类肿瘤及非肿瘤组织中占主导形式的血管生成方式，相关讨论见受邀综述论文^1,2通过腹腔内（i.p.）注射促血管生成因子可在肠系膜膜状部分诱导血管生成，该过程可通过皮下（s.c.）、静脉内（i.v.）或口服（p.o.）给予选定的调节剂进行调控。肠系膜的每个膜状部分均呈半透明状，并由脂肪组织包绕，呈现出类似窗口的外观。

该检测具有以下优势：（i）测试组织本身具有血管化，尽管血管分布稀疏，但由于组织极薄，其微血管网络近乎二维结构，因此可借助显微镜对整个网络进行评估 原位； （ii）在成年大鼠中，待测组织缺乏显著的生理性血管生成，而后者是大多数正常成年哺乳动物组织的特征；然而，如文中所述，组织固有血管化程度与年龄相关。¹（iii）创伤诱导的血管生成水平极低，可确保高灵敏度；（iv）该检测方法可模拟临床情况，因为用于调节血管生成的试验药物通过全身给药，所观察到的反应反映了治疗所引起的所有代谢、细胞和分子改变的综合效应；（v）该检测方法可对微血管空间扩展、密度及网络模式形成的客观、定量且无偏倚的变量，以及毛细血管出芽情况进行评估，从而支持对结果进行可靠的统计分析 剂量-效应 和 分子 结构-活性 关系；以及（vi）该检测方法具有高灵敏度，能够揭示治疗措施对成年大鼠生理体重增长速率的毒性或有害影响，因为成年大鼠的体重增长显著。

肥大细胞介导的血管生成最初通过该实验方法得以证实^3,4。该模型在剂量-效应关系以及系统给予的化学结构或功能相近的药物和蛋白质所产生的效应方面表现出高度的区分能力，包括：(i) 低剂量、节律性给药的标准化疗药物，可产生多样且药物特异性的效应（即，抑制血管生成、中性或促进血管生成的活性⁵）；(ii) 天然铁未饱和的人乳铁蛋白，可促进由 VEGF-A 介导的血管生成⁶，以及天然铁未饱和的牛乳铁蛋白，可抑制由 VEGF-A 介导的血管生成⁷；(iii) 通过不同方法制备的低分子量肝素组分^8,9。此外，该实验方法非常适用于研究以同时或序贯方式系统给予的多种试剂对血管生成的联合效应。

制作本视频的想法源于已故的 Judah Folkman 博士访问我们实验室并目睹该方法的演示时。

综述论文（特邀），对检测方法进行讨论和评价

Norrby, K. 体内 血管生成模型. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).

Norrby, K. 使用血管生成模型进行药物测试。Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008)。

方案

1. 动物

1. 小型啮齿类动物，如大鼠、小鼠和豚鼠，曾被用作动物模型。然而，成年小鼠（已评估多个品系）的肠系膜窗内通常缺乏或仅有极少量的潜在亲本微血管（即能够启动血管生成的微血管），这使得使用小鼠进行的研究结果不可靠。因此，该实验方法主要针对大鼠开发。
2. 大鼠在从繁殖单位接收后，需在标准环境中适应至少7天，通常每两只共养于一个标准笼具中，维持12小时光照/12小时黑暗的循环条件，并可自由获取饮水和颗粒饲料。每只动物均进行标记。我们主要使用年轻成年大鼠（通常为7–10周龄，来自不同品系，但通常为雄性Sprague-Dawley大鼠；5–6周龄以下的大鼠体内天然微血管数量往往较低），来源包括多个繁殖单位。在实验前及整个实验期间，每隔一天称重一次，且在处死当天必须称重。若动物同时接受腹腔注射（用于诱导血管生成，见下文）以及皮下、静脉或口服给药，则需每日称重。这有助于在实验开始时建立体重相等的实验组与对照组，并可监测治疗对实验过程中体重增长的影响。由于成年雄性大鼠具有较强的生理性生长能力（每周增重约40–60 g，具体取决于品系），体重增长迟缓可作为毒性、全身健康状况、厌食及发育不良的敏感替代指标。

我们在高标准的动物护理设施中开展工作，并尽最大努力减少动物所经历的压力。目前遵循的伦理准则由 Workman P. et al. 制定（《癌症研究中动物福利与使用的指南》，Br. J. Cancer 102, 1555-77, 2010）。哥德堡大学动物伦理委员会已批准本研究。

2. 促血管生成的腹腔内治疗

1. 待测的候选促血管生成因子需溶解并稀释于无内毒素的生理盐水中（即使极低水平的内毒素也具有促血管生成作用）。所有溶液均于注射当日新鲜配制，经无菌过滤（Millipore 0.22 μm 滤膜），检测pH值为中性（7.1–7.3），并在室温下使用。
   测试剂以低浓度或极低浓度注射。例如，大鼠 rVEGF₁₆₄ (564-RV/CF；R&D Systems Europe, Ltd., Oxon, 英国）生产的、在大鼠中占主导的VEGF-A亚型，用无内毒素的生理盐水稀释至96 pmol/ml，经冻融后，腹腔注射5 ml至大鼠体内。我们采用5 ml注射器配0.8 mm针头（绿色针头，21G）进行腹腔注射。该处理每日两次，持续4.5天。 即从周一早晨（第0天）到周五早晨（第4天）期间，在肠系膜检测组织中诱导出显著的出芽性血管生成反应，该反应在约第21天达到峰值。
   腹腔注射该溶液可确保全部体积进入腹膜腔（而非肠道、膀胱或其他任何器官）。快速注射5 ml液体可使操作者通过触觉确认液体流已穿过腹壁进入腹腔。
   随后，可在腹腔注射促血管生成治疗之前、同时或之后，系统性给予任何选定的试验药物。

3. 血管生成调节剂的全身给药

1. 除腹腔注射（i.p.）外，可采用任何其他给药途径，因为腹腔注射可能通过诱导炎症反应，或可能通过激活测试组织中的肥大细胞，影响正在进行的血管生成反应，从而引发强烈的促血管生成效应。除口服给药或皮下（s.c.）、静脉（i.v.）单次注射外，我们常采用渗透压微型泵进行皮下给药（可使用一个或多个泵，体积和泵送时间各异），以实现持续恒速给药，持续时间可达一至数周。
2. 持续皮下输注试验药物
   渗透压微型泵的填充与植入
   通常在第5天， 即， 在腹腔注射VEGF治疗结束后的第2天，于无菌条件下将渗透压微型泵（例如，型号2ML2，恒定泵速为5.0 μl/h，持续14–15天；Alzet Osmotic Pumps，Mountain View，CA，USA）填充待测药物或相应的溶剂。将泵置于无菌的0.9%（w/v）NaCl溶液中，于37°C过夜孵育后，通过手术将其皮下植入已使用异氟烷气体（Isoba vet；Schering-Plough Animal Health，Merck）麻醉的大鼠背部（脊柱侧肩胛骨区域）。 & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA)，首先置于密闭透明舱内，随后通过面罩给予（为尽量减少对后续实验动物造成的应激，每次使用后均用空气冲洗舱体）。泵植入后立即使用丝线缝合皮肤切口。
   由于动物在实验期间会生理性增重，而受试药物以恒定速率给药，因此所选测试药物按每千克体重计算的实际剂量在输注期开始时高于平均剂量，在输注期结束时低于平均剂量。
   持续输注可被视为节律性治疗的一种延伸形式。

4. 结束实验

1. 每次将一只动物放入一个透明的密闭容器中，通入 CO₂ 气体使其迅速死亡。每次使用后需用空气冲洗容器，方可再次使用。

5. 收集组织样本

1. 如DVD所示，打开腹壁并识别小肠系膜，包括延伸至回盲瓣（小肠与大肠的连接处）的最远端部分。将位置最远端的四个（或更多）“窗状”系膜结构编号，并展平于标准未处理的Superfrost Plus载玻片（DAKO Denmark A/S，Glostrup，丹麦）上。应尽可能避免样本被血液、肠道内容物或其他体液污染，因为这些物质可能会产生非特异性染色，尽管这并不会影响后续对微血管的免疫组织化学可视化观察。
2. 每个带有附着小肠节段的系膜窗标本均展平于载玻片上，并在室温下干燥20分钟。随后切除肠残端，而完整的膜状系膜标本则可长期保存于-20°C环境中。此操作过程见DVD演示。

需要指出的是，在收获组织之前，可利用透射光活体显微镜观察组织及通畅的血管系统。

6. 微血管免疫组织化学染色实验方案

1. 第0天
   将样本从 -20°C 缓慢升至室温使其解冻，在 60°C 的烘箱中干燥 1 小时，然后于室温下放置过夜。
2. 第1天
   将载玻片放入染色架中（每隔一个槽位放置），置于染色缸内，用 TBS（pH 7.8）在室温下洗涤两次，每次 10 分钟。弃去溶液，更换为下一步所用溶液，后续所有步骤依此类推。
3. 胰蛋白酶处理
   将胰蛋白酶溶液加入将要放置染色片架的染色缸中（25°C，20分钟）。弃去溶液，用2.5%蔗糖溶液孵育两次（每次室温10分钟）。弃去溶液，用蒸馏水冲洗数次 去离子水 （室温下各放置几分钟）。
4. 封闭
   将盛放染色玻片架的染色缸中装入0.5% H₂O₂ 在甲醇中（室温下30分钟）。弃去溶液，用 去离子水 （室温放置数分钟）。弃去溶液，用 TBS（pH 7.4）洗涤两次，每次 8 分钟（室温）。
5. 孵育
   所有孵育步骤均在室温下的湿盒中进行。每个载玻片使用以下所列溶液各约150 μl。将载玻片置于湿盒中，用移液器将溶液加至样本上（非膜部分无需覆盖溶液）。
   在进行以下每一步操作时，均需在加入后续溶液前仔细将所有溶液摇净。
   1. 正常（封闭）血清孵育 （马）（ABC试剂盒） 3滴 黄色溶液/10 ml 稀释缓冲液中孵育 20 分钟。
   2. 一抗孵育 ARU0181，可标记大鼠血管内皮细胞。将抗体用稀释缓冲液（Biosource）按1:600稀释（100 μl 抗体原液经40倍稀释[冻存]后加入900 μl 稀释缓冲液），于4°C孵育过夜。
6. 第2天
   将载玻片从湿盒中取出，弃去一抗，将载玻片放入染色架中，浸入染色缸，用TBS（pH 7.8）冲洗两次，每次8分钟。
   1. 与生物素化抗体孵育 （ABC试剂盒）
      将载玻片水平放置于湿盒中，每张滴加1滴进行孵育 蓝色溶液加入10 ml稀释缓冲液，孵育30分钟。弃去溶液，将切片置于染色架中，浸入染色缸，用TBS（pH 7.4）冲洗两次，每次8分钟。
   2. 与ABC试剂孵育
      载玻片再次水平放置于湿盒中，然后将以下溶液滴加到标本的膜状部位：2滴 橙色溶液 加上2滴 棕色溶液/10 ml TBS（pH 7.4）中孵育30分钟。轻柔混匀30分钟 之前 使用！弃去溶液，将切片放入染色缸的切片架中，用TBS（pH 7.4）冲洗两次，每次8分钟。
7. DAB（0.05%）染色
   此步骤必须在通风橱中进行！
   将切片放置好，并用移液器加入3,3-二氨基联苯胺（DAB；Sigma-Aldrich）溶液：将0.1% DAB溶液（溶于TBS，pH 7.4，冷冻保存）与10 μl H₂O₂的混合液等体积混合后使用₂O₂ 以及7.5 ml TBS（pH 7.4）。该溶液在使用前需经无菌滤膜过滤（以去除可能影响显微观察的颗粒物）。将标本染色8分钟。弃去染液，将载玻片放入染色架中，并浸入染色缸内。用流动的自来水冲洗，随后用 去离子水 几分钟。
8. 脱水
   将载玻片保留在染色片架中。通过弃去并重新填充含有染色液的染色缸进行冲洗 去离子水/乙醇: 去离子水70% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇，每种溶液中各浸泡 2 分钟。

7. 血管内皮细胞免疫组织化学染色后对每个肠系膜窗标本微血管网络的成像与评估

如影片所示，微血管在显微镜下可见 原位 在完整组织中。

1. 首先，我们使用放大倍数范围为14至34倍的绘图显微镜（Leica Wild M 3Z），在白纸上用铅笔描出每个肠系膜窗的整个窗口区域以及全部血管化区域（VA）。VA占整个区域的百分比可通过计算机化或非计算机化的平面测量法轻松测定（也可通过剪下整个窗口图像及其所有血管化部分的图像并称重来简单估算）。
2. 利用另一台绘图显微镜，在随机选择的视野中以80倍放大倍数用黑色墨水在白纸上描绘出易于识别的单个微血管轮廓。这是后续对微血管长度（MVL）进行计算机辅助形态计量分析的起点，MVL本质上是微血管密度的测量指标。
3. 可选地，还可测定与微血管模式形成相关的参数，以及用于评估微血管芽数量和单个微血管芽长度（分别记为No. SP和Le. SP）的变量。描绘出的黑色血管结构与白色背景之间具有最佳对比度，有利于在大多数商用计算机化形态计量软件中对图像进行详细分析。
4. 在大多数情况下，主要变量为VA和MVL，二者相乘可得到总微血管长度（TMVL）。

8. 统计分析

我们通常采用标准的非参数 Mann-Whitney U 检验来分析非配对（双尾）观察数据。每个动物的肠系膜窗口以四个视野的均值作为每个变量的独立数据点。统计学显著性的判定标准为 P ≤ 0.05。

讨论

该检测方法于1986年首次提出³ 并在我们的实验室中被持续地进一步开发和完善^7,10-12如综述论文（特邀）中所述^{1, 2}，该检测方法与其他哺乳动物的检测方法相比具有良好的可比性 在体内 在血管生成实验中，该方法具有若干重要优势：成年测试组织本身具有血管化特征，且缺乏生理性血管生成；对组织造成的创伤极小，甚至无创伤；可测量真正具有定量意义的变量，从而能够对剂量-反应关系及分子活性研究进行可靠的统计学分析；能够发生出芽式血管生成，而这种模式在正常组织和肿瘤中均占主导地位；此外，在生理状态稳健的成年大鼠中易于积累毒性数据。然而，该方法也存在一些不足之处：实验相对耗时，尤其是在评估单个微血管节段和微血管出芽的数量与长度时；无法实现对过程的实时或连续观察；此外，该方法在小鼠中应用极为困难，因为许多小鼠肠系膜窗缺乏可作为新生毛细血管起源的潜在母体微血管。

然而，通过活体显微镜技术可以实现实时观察，如文献¹所述，在动物麻醉状态下，将外置但保持完整的肠系膜窗口展开并覆盖在显微镜载物台上进行观察。

过去几十年中，利用角膜微囊、鸡胚尿囊膜以及皮下Matrigel栓塞等模型，在血管生成研究领域已取得重大进展，这些模型虽然有用，但终究存在局限性。抗血管生成和促血管生成疗法未来的临床应用，迫切需要建立并验证更为敏感、更具生物学相关性且真正定量的临床前模型，例如本报告中所描述的模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
缓冲液与试剂
0.5 M Tris-HCl（pH 7.8）贮存液 三（羟甲基）氨基甲烷（60.57 g）溶于约900 ml 去离子水 并加入约45 ml的25% HCl（浓盐酸）以调节pH至7.8，随后用 去离子水.
Tris-缓冲盐溶液（TBS；pH 7.8） 向200 ml贮备液中加入18 g NaCl，溶解于约1800 ml水中 去离子水 使用储备液调节 pH 至 7.8，然后用溶剂定容至 2 升 去离子水.
TBS（pH 7.4） 向200 ml贮备液中加入18 g NaCl，溶于约1800 ml水中 去离子水 用储备液调节 pH 至 7.4，然后加水稀释至 2 升 去离子水.
胰蛋白酶溶液（0.05% 胰蛋白酶，0.1% CaCl₂）2) 含有 0.1 g 胰蛋白酶和 0.2 g CaCl₂2 在 200 ml TBS（pH 7.8）中
2.5% 蔗糖溶液 含 5 g 蔗糖的 200 ml TBS 溶液（pH 7.8）。
1% 叠氮化钠在 TBS（pH 7.4）中的储备液 含 1 g 叠氮化钠（Na-azide）的 100 ml TBS 溶液（pH 7.4）。
稀释缓冲液：0.1% BSA，0.01% Na-叠氮化物 （用于稀释Vectastain ABC试剂盒中的抗体）。每100 ml TBS（pH 7.4）中含有0.1 g牛血清白蛋白（BSA）和1 ml 1%叠氮钠。
ABC试剂盒 Vectastain PK 4002，ABC辣根过氧化物酶小鼠IgG 正常马血清；封闭血清 黄色溶液3滴/10 ml稀释缓冲液 生物素化抗体；抗小鼠IgG 蓝色溶液1滴/10 ml稀释缓冲液 ABC试剂： 橙色溶液，2滴加 棕色溶液 2滴/10 ml TBS（pH 7.4）
将这些溶液混合20分钟 之前 使用！
小鼠（单克隆）抗大鼠内皮细胞抗体（Biosource International，Camarillo，CA，美国）
该抗体针对大鼠体内所有血管内皮细胞，但脑组织中的内皮细胞除外。
Vectastain 辣根过氧化物酶亲和素-生物素复合物（ABC）试剂盒 试剂盒包含一抗、生物素标记的二抗、亲和素-生物素化酶复合物（ABC）以及酶底物。参见 www.vectorlabs.com 或 www.immunkemi.se 用于实验方案。
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，货号 # A-4503）。 DAB= 3,3’-二氨基联苯胺 Isopac（Sigma-Aldrich，货号 # D 9015） 胰蛋白酶来自牛胰腺（Sigma-Aldrich，货号 # T 4665）。 Vectastain 辣根过氧化物酶 ABC 试剂盒，小鼠 IgG（Immunkemi F & D AB，Jarfalla，瑞典