免疫组织化学：使用Vector Labs Vectastain ABC试剂盒的石蜡切片法

摘要

免疫组织化学（IHC）是一种利用特异性抗体在固定组织切片中定位/可视化蛋白质表达的有价值技术。该技术分为两种方法：直接法和间接法。本实验仅描述间接免疫组织化学染色的使用。间接IHC染色采用高特异性的初级抗体和生物素偶联的次级抗体。初级抗体通过结合特定表位来特异性识别目标蛋白，而次级抗体则有助于消除非特异性背景染色，并通过与初级抗体形成复合物来放大信号。载玻片样本可来源于冰冻切片或包埋于石蜡后固定在玻璃载玻片上的切片。在本方案中，我们讨论了石蜡包埋切片的制备过程，包括脱蜡、梯度酒精水化、热诱导抗原修复，以及内源性过氧化物酶活性和非特异性结合位点的封闭。部分切片随后用针对T细胞标志物CD8的抗体进行染色，而另一些切片则用酪氨酸羟化酶特异性抗体染色。接着，切片孵育相应的生物素偶联次级抗体，再使用与亲和素偶联的辣根过氧化物酶（HRP）及以二氨基联苯胺（DAB）为底物进行显色反应。显色完成后，切片进行对比染色（复染），并用中性树胶封片。在充分干燥后，这些切片即可用于成像。 关键词：免疫组织化学，IHC，间接染色，石蜡包埋切片，CD8，酪氨酸羟化酶，DAB，HRP，生物素，抗原修复

方案

石蜡切片染色

1. 用二甲苯（Fisher X3^S-4）脱蜡，每次5分钟，共3次（根据使用频率每月更换一次二甲苯，二甲苯具有毒性）。使用Fisher货号08-812-1A的培养皿及配套盖子，以及适配该培养皿的支架，每个培养皿加入200 ml液体。
2. 按以下梯度酒精水化（每两周更换一次梯度试剂）：
   • 100% 乙醇（Fisher # A406-20）中浸泡2次，每次2分钟
   • 95% 乙醇中浸泡2次，每次2分钟
   • 70% 乙醇中浸泡1次，2分钟
   • 50% 乙醇中浸泡1次，2分钟
   • 30% 乙醇中浸泡1次，2分钟
   • ddH₂O 中浸泡1次，2分钟
3. 在DPBS中浸泡5分钟（DPBS = 含Ca²⁺和Mg²⁺的杜氏改良磷酸盐缓冲液）。

抗原修复：

1. 将柠檬酸钠缓冲液（10 mM，pH 6.5）在微波炉中预热。
2. 将载玻片在微波炉中加热15分钟。加热过程中载玻片切勿干燥，需每分钟检查一次，必要时补充柠檬酸钠（Na-Citrate）。
3. 室温下冷却。
4. 用1% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶活性₂O₂ 在DPBS中孵育20分钟（50 ml DPBS中加入1.5 ml 30%储备液，Sigma H-1009）。
5. 在DPBS中浸泡，每次5分钟，共3次。
6. 在DPBS中加入5%牛血清白蛋白（BSA）、0.1%叠氮化钠和5%血清，于4°C孵育过夜以封闭非特异性位点。
   
   注意：封闭用血清的选择取决于用于染色的抗体所来源的物种。应使用与二抗（偶联生物素）相同物种来源的血清进行封闭。若该血清不可获得，可选用与一抗来源物种不同的其他物种血清。
   
   
7. 使用亲和素/生物素封闭试剂盒（Vector Laboratories 目录号 # SP-2001）封闭生物素位点：
   • 用Avidin D孵育15分钟。用DPBS短暂漂洗。
   • 在生物素溶液中孵育15分钟。
8. 在室温下，用一抗溶液（DPBS + 2% BSA + 0.1% NaAzide + 2% 血清，与封闭步骤所用血清相同）孵育 2 小时。
9. 在 PBS 中浸泡，每次 5 分钟，共 3 次。
10. 在 DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% 血清（与封闭步骤所用相同）中，室温下与生物素标记的二抗孵育 1 小时。
11. 同时配制ABC试剂，因其必须在使用前孵育至少30分钟！！！（见材料）
12. 在50 ml锥形管中配制。加入15 ml不含血清和叠氮化钠的DPBS，再加入3滴试剂A，混匀，随后加入3滴试剂B并混匀。避免挤压试剂瓶，应等待液滴自然形成。ABC试剂盒为Vector Labs生产的Vectastain PK-6100。
13. 在DPBS中浸泡，每次5分钟，共3次。
14. 室温下用ABC试剂孵育30-45分钟。
15. 在DPBS中浸泡，每次5分钟，共3次。
16. 按说明书配制 DAB 过氧化物酶底物（Vector Labs # SK-4100）于 5 ml ddH₂O 中₂O 在玻璃小瓶中 使用前立即 （参见材料）
    • 2滴缓冲液原液，混匀
    • 4滴DAB，混匀（应变为微褐色）
    • 2滴H₂O₂，混合
17. 在载玻片上滴加DAB底物，并观察棕褐色染色。
18. 将载玻片浸入冰水混合物中以终止反应。
19. 用冷水冲洗5分钟。
20. 用苏木精（20秒；Fisher CS401-D）复染，然后用自来水冲洗至流水变清澈。
21. 通过酒精梯度脱水，从30%乙醇开始至100%乙醇（每个浓度2分钟）。
22. 二甲苯浸泡，每次5分钟，共3次。
23. 用Permount（Fisher # SP15-100）封片：在载玻片的切片上滴加少量封片剂，然后缓慢盖上盖玻片，确保无气泡产生。在完全干燥前，不得移动盖玻片，这需要 耗时约 24 小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲苯	Fisher Scientific	X3S-4	根据使用频率每月更换一次二甲苯。二甲苯具有毒性。
100% 乙醇	Fisher Scientific	A406-20	用于配制乙醇梯度溶液。
DPBS			Dulbecco’s 改良磷酸盐缓冲液（含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）
柠檬酸钠缓冲液			10 mM，pH 6.5
H₂O₂	Sigma-Aldrich	H-1009	30% 原液 => 用 DPBS 稀释至 1%
封闭液			DPBS + 5% 牛血清白蛋白 (BSA) + 0.1% 叠氮化钠 + 5% 血清
BSA
叠氮化钠			NaAzide
亲和素/生物素封闭试剂盒	Vector Laboratories	SP-2001
抗体缓冲液			DPBS + 2% BSA + 0.1% 叠氮化钠 + 2% 血清（与封闭步骤所用血清相同）
ABC 试剂盒 Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB 过氧化物酶底物	Vector Laboratories	SK-4100
ddH₂O
苏木精	Fisher Scientific	CS401-D	复染剂
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
载玻片和盖玻片			玻璃材质