使用流式细胞术检测小胶质细胞对玻璃体内递送的荧光颗粒的摄取

摘要

来源：Murinello, S. 等人， 评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 在体 内 基于流式细胞术的检测方法 视频实验杂志 (2016)

本视频演示了在小鼠眼内玻璃体腔注射后，通过流式细胞术检测小胶质细胞对荧光生物颗粒的摄取。流式细胞术可检测表达 CD11b 的活细胞，并能将表现出绿色荧光的吞噬性小胶质细胞与其他髓系细胞（包括表达 Ly6C 的单核细胞和表达 Ly6G 的中性粒细胞）区分开来。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 注射材料的准备

1. 对33 G针头和注射器进行灭菌：拆卸后在115 ^οC下进行高压灭菌。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗针头，以备注射使用。
2. 将荧光标记的颗粒在室温下解冻5 - 10分钟。用含钙离子和镁离子（Ca²⁺/Mg²⁺）的无菌PBS将颗粒重新配制成50 mg/ml的溶液，以备注射。
   注意：本实验方案使用经验证适用于吞噬作用检测的真菌来源AF488标记颗粒。为获得最佳摄取效果，应在注射前新鲜配制颗粒溶液。
   注意2：颗粒浓度可根据每个具体实验进行优化。

2. 玻璃体内注射微珠溶液

注意：注射操作需要两人配合完成，其中一人负责持鼠并保持对眼球的观察，另一人负责传递已装液的注射器并推动针栓。

1. 通过腹腔注射给予啮齿类动物100 mg/ml的氯胺酮和10 mg/ml的赛拉嗪，剂量为每10 g体重20 µl。注射前，使用脚趾夹捏法评估麻醉深度。
   注意：异氟烷对髓系细胞功能有显著影响，因此在整个实验过程中应避免使用。
2. 用0.5 µl荧光标记的颗粒溶液填充针头。
3. 将小鼠侧卧置于手术显微镜下（图1A-B）。使用柔软材料（例如凝胶垫）以更好地固定小鼠体位。对于眼睛尚未睁开的幼鼠，可借助精细的45^o角镊子沿眼裂轻轻施力，制造一条缝隙，使眼睑逐渐打开。
   1. 借助精细的45^o角镊子，小心地在眼睑周围施加压力，使眼球轻微突出于眼窝。用两根手指分别固定耳部上方和下颌以稳定头部，并沿眼睑方向轻轻拉伸皮肤，使眼球保持轻微突出状态。注意不要过于靠近喉部（图1B）。
4. 为穿刺眼球，将注射器针头插入角膜缘（即角膜与巩膜连接处）。在有色小鼠中，此处可见为一个灰色环状区域。稍微回撤针头，排出少量玻璃体液后进行注射。操作者应一手轻握小鼠，另一手持针；助手则应缓慢推动针栓。
5. 缓慢拔出注射器。滴加眼部保湿液以保持眼球湿润。
6. 将啮齿类动物置于带有加热垫的笼中恢复，并持续监测动物状态。若操作对象为幼鼠，在其恢复自主呼吸和自发运动能力之前，不得将其放回与其他清醒动物共处的笼中。若操作对象为成年鼠，则需待其恢复胸卧位后，方可将其放回与其他清醒动物共处的笼中。

3. 视网膜组织的收获

注意：应收集未注射荧光标记颗粒的眼睛的视网膜组织，作为流式细胞术分析的对照。尽管该实验可使用单个视网膜进行，但为了获得最佳效果，建议将两个视网膜合并使用。

1. 在玻璃体内注射荧光标记颗粒后3小时收集视网膜组织。
   注意： 虽然颗粒溶液注射后的时间可根据每个具体实验进行优化，但我们发现注射后3小时可在视网膜的大部分层中观察到颗粒摄取（图1C-D）。
2. 通过颈椎脱位法处死小鼠。
3. 使用精细的45^o角镊子轻轻按压眼睑，使眼球突出，随后用镊子夹住眼球后方并拉出以取出眼球。
4. 在解剖显微镜下分离视网膜。将眼球转移至含有少量含Ca²⁺/Mg²⁺ PBS的培养皿中。在培养皿干燥区域，用超细镊子尖端在角膜缘处刺穿眼球。
5. 用精细的45^o角镊子固定眼球，使用弹簧剪沿角膜缘剪开，直至大约剪开角膜缘周长的一半。
6. 用精细的45^o角镊子夹住眼球并将其浸入PBS中。用另一把精细的45^o角镊子撕开角膜和巩膜，使晶状体和视网膜完整地取出。
7. 分离晶状体和视网膜。收集视网膜并转移至含有2 ml含Ca²⁺/Mg²⁺ PBS的5.4 ml聚苯乙烯试管中。

4. 制备单细胞悬液

1. 使用神经组织解离试剂盒制备单细胞悬液，对生产商提供的说明书进行少量修改。简而言之，用P1000移液器反复吹打视网膜组织，并在37 ^oC下进行酶消化，不摇动。

5. 用于流式细胞术分析的单细胞悬液染色

1. 用 200 µl 染色缓冲液（含 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.09% 叠氮化钠的杜氏磷酸盐缓冲液）重悬细胞，并转移至 U 型底 96 孔板中。在 130 × g 条件下离心 5 分钟。
   注意：叠氮化钠对人体和环境有害。请使用适当的个人防护装备，并根据当地法规处理废弃物。
2. 将板倒置于水槽上方，弃去上清液。为阻断 Fc 受体，每孔加入含 5 µg/ml 抗小鼠 CD16/CD32 抗体的 25 µl 染色缓冲液重悬细胞。室温孵育 5 分钟。
3. 加入 25 µl 染色缓冲液，其中含 0.5 µg/ml 抗小鼠 Ly6C-APC-Cy7、0.5 µg/ml 抗小鼠 Ly6G-Pe-Cy7 和 2.5 µg/ml 抗小鼠 CD11b-BV650。避光，室温孵育 15 分钟。
4. 在 130 × g 条件下离心 5 分钟。倒置平板以弃去上清液。用 200 µl 染色缓冲液重悬细胞进行洗涤。
5. 在 130 × g 条件下离心 5 分钟。用含 0.5 µg/ml 碘化丙啶（PI）的 200 µl 染色缓冲液重悬细胞，转移至 1.2 ml 微量滴定管中。
6. 用额外的 100 µl 含 0.5 µg/ml PI 的染色缓冲液洗涤各孔，并将洗液与前述 200 µl 液体合并至 1.2 ml 微量滴定管中。最终获得 300 µl 染色细胞悬液。

6. 流式细胞术分析

1. 使用传统的三激光系统（紫色、蓝色和红色激光）时，应避免使用PE、PerCP-Cy5.5、BV510和PI染料，因为这些染料会受到极强荧光AF488颗粒的显著溢出干扰。建议增加第四根（黄色）激光以优化本实验方案，因为该配置允许使用PE标记的抗体以及将PI染料检测通道由PerCP-Cy5.5通道转移至mCherry通道（图2）。
   注意：若无黄色激光，可在其他通道中使用死细胞排除染料。
2. 对PI阴性细胞（PI-）设门，以排除死细胞（图2B）。
3. 在排除死细胞后，对CD11b阳性细胞（CD11b⁺）设门，该群包含所有髓系细胞（图2C）。
4. 在CD11b⁺细胞群中，进一步对Ly6C^-/Ly6G^-细胞设门，以排除中性粒细胞（CD11b⁺/Ly6G⁺）和单核细胞（CD11b⁺/Ly6C⁺；图2D）。将小胶质细胞定义为CD11b⁺/Ly6C^-/Ly6G^-（为简化起见），此时应可观察到两个明显不同的细胞群：一个为荧光标记颗粒阴性，另一个为阳性。吞噬性细胞已摄取颗粒，因此表现为AF488⁺（图2E）。
   注意：也可分析Ly6C阳性或Ly6G阳性细胞群，以利用此染色方法检测颗粒摄取情况。吞噬性CD11b⁺细胞的比例与吞噬性小胶质细胞的比例具有良好的相关性（图2F）。对于无流式细胞术经验的研究人员，可仅通过CD11b染色进行更简单的分析，但该方法会同时包含吞噬性中性粒细胞、单核细胞及小胶质细胞。在CD11b⁺/Ly6C^-/Ly6G^-细胞群中，根据F4/80和CX3CR1标志物染色判断，这些细胞> 99%为小胶质细胞；这些标志物可添加使用，但在我们实验中并非必需。

结果

图1：玻璃体内注射装置及显示视网膜各层中荧光标记颗粒的代表性视网膜切片。（A） 在解剖显微镜下放置一个凝胶垫。（B） 如图所示固定啮齿类动物，以使眼睛处于适合进行玻璃体内注射的位置。（C） 注射后3小时，可在大部分视网膜层中观察到荧光标记的颗粒。（D, E） 使用CX3CR1^GFP/GFP小鼠，并用红色荧光染料标记颗粒，以观察小胶质细胞对颗粒的摄取情况。深层（D）和浅层（E）的小胶质细胞均摄取了颗粒。比例尺 — 20 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视显微镜	Nikon	已停产
Hamilton 注射器，600 系列	Sigma	26702
33 号针头，小接头 RN 针，0.5 英寸，4 - 12o 斜面	Hamilton	7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles，Alexa Fluor 488 标记物	ThermoFisher Scientific	Z-23373	注射前立即配制
DPBS	Corning	21-030-CV
Dumont #5/45 镊子	Fine Science Tools	11251-35	需要两个
Dumont #5SF 镊子	Fine Science Tools	11252-00
Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口	Fine Science Tools	15000-10	弯曲型
神经组织解离试剂盒 – 新生神经元	Miltenyi Biotec	130-094-802
5 mL 聚苯乙烯圆底管	Falcon	352054
96 孔 U 型底板	Falcon	353077
染色缓冲液（BSA）	BD Biosciences	554657
CD11b-BV650 抗体	BioLegend	101259
Ly6C-APC-Cy7	BioLegend	128025
Ly6G-PE-Cy7	BioLegend	127617
碘化丙啶	BD Biosciences	556463
纯化抗小鼠 CD16/32 抗体	BioLegend	101301