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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 注射材料的准备
- 对33 G针头和注射器进行灭菌：拆卸后在115 οC下进行高压灭菌。用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗针头，以备注射使用。
- 将荧光标记的颗粒在室温下解冻5 - 10分钟。用含钙离子和镁离子（Ca2+/Mg2+）的无菌PBS将颗粒重新配制成50 mg/ml的溶液，以备注射。
注意：本实验方案使用经验证适用于吞噬作用检测的真菌来源AF488标记颗粒。为获得最佳摄取效果，应在注射前新鲜配制颗粒溶液。
注意2：颗粒浓度可根据每个具体实验进行优化。
2. 玻璃体内注射微珠溶液
注意：注射操作需要两人配合完成，其中一人负责持鼠并保持对眼球的观察，另一人负责传递已装液的注射器并推动针栓。
- 通过腹腔注射给予啮齿类动物100 mg/ml的氯胺酮和10 mg/ml的赛拉嗪，剂量为每10 g体重20 µl。注射前，使用脚趾夹捏法评估麻醉深度。
注意：异氟烷对髓系细胞功能有显著影响，因此在整个实验过程中应避免使用。
- 用0.5 µl荧光标记的颗粒溶液填充针头。
- 将小鼠侧卧置于手术显微镜下（图1A-B）。使用柔软材料（例如凝胶垫）以更好地固定小鼠体位。对于眼睛尚未睁开的幼鼠，可借助精细的45o角镊子沿眼裂轻轻施力，制造一条缝隙，使眼睑逐渐打开。
- 借助精细的45o角镊子，小心地在眼睑周围施加压力，使眼球轻微突出于眼窝。用两根手指分别固定耳部上方和下颌以稳定头部，并沿眼睑方向轻轻拉伸皮肤，使眼球保持轻微突出状态。注意不要过于靠近喉部（图1B）。
- 为穿刺眼球，将注射器针头插入角膜缘（即角膜与巩膜连接处）。在有色小鼠中，此处可见为一个灰色环状区域。稍微回撤针头，排出少量玻璃体液后进行注射。操作者应一手轻握小鼠，另一手持针；助手则应缓慢推动针栓。
- 缓慢拔出注射器。滴加眼部保湿液以保持眼球湿润。
- 将啮齿类动物置于带有加热垫的笼中恢复，并持续监测动物状态。若操作对象为幼鼠，在其恢复自主呼吸和自发运动能力之前，不得将其放回与其他清醒动物共处的笼中。若操作对象为成年鼠，则需待其恢复胸卧位后，方可将其放回与其他清醒动物共处的笼中。
3. 视网膜组织的收获
注意：应收集未注射荧光标记颗粒的眼睛的视网膜组织，作为流式细胞术分析的对照。尽管该实验可使用单个视网膜进行，但为了获得最佳效果，建议将两个视网膜合并使用。
- 在玻璃体内注射荧光标记颗粒后3小时收集视网膜组织。
注意： 虽然颗粒溶液注射后的时间可根据每个具体实验进行优化，但我们发现注射后3小时可在视网膜的大部分层中观察到颗粒摄取（图1C-D）。
- 通过颈椎脱位法处死小鼠。
- 使用精细的45o角镊子轻轻按压眼睑，使眼球突出，随后用镊子夹住眼球后方并拉出以取出眼球。
- 在解剖显微镜下分离视网膜。将眼球转移至含有少量含Ca2+/Mg2+ PBS的培养皿中。在培养皿干燥区域，用超细镊子尖端在角膜缘处刺穿眼球。
- 用精细的45o角镊子固定眼球，使用弹簧剪沿角膜缘剪开，直至大约剪开角膜缘周长的一半。
- 用精细的45o角镊子夹住眼球并将其浸入PBS中。用另一把精细的45o角镊子撕开角膜和巩膜，使晶状体和视网膜完整地取出。
- 分离晶状体和视网膜。收集视网膜并转移至含有2 ml含Ca2+/Mg2+ PBS的5.4 ml聚苯乙烯试管中。
4. 制备单细胞悬液
- 使用神经组织解离试剂盒制备单细胞悬液，对生产商提供的说明书进行少量修改。简而言之，用P1000移液器反复吹打视网膜组织，并在37 oC下进行酶消化，不摇动。
5. 用于流式细胞术分析的单细胞悬液染色
- 用 200 µl 染色缓冲液（含 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.09% 叠氮化钠的杜氏磷酸盐缓冲液）重悬细胞，并转移至 U 型底 96 孔板中。在 130 × g 条件下离心 5 分钟。
注意：叠氮化钠对人体和环境有害。请使用适当的个人防护装备，并根据当地法规处理废弃物。
- 将板倒置于水槽上方，弃去上清液。为阻断 Fc 受体，每孔加入含 5 µg/ml 抗小鼠 CD16/CD32 抗体的 25 µl 染色缓冲液重悬细胞。室温孵育 5 分钟。
- 加入 25 µl 染色缓冲液，其中含 0.5 µg/ml 抗小鼠 Ly6C-APC-Cy7、0.5 µg/ml 抗小鼠 Ly6G-Pe-Cy7 和 2.5 µg/ml 抗小鼠 CD11b-BV650。避光，室温孵育 15 分钟。
- 在 130 × g 条件下离心 5 分钟。倒置平板以弃去上清液。用 200 µl 染色缓冲液重悬细胞进行洗涤。
- 在 130 × g 条件下离心 5 分钟。用含 0.5 µg/ml 碘化丙啶（PI）的 200 µl 染色缓冲液重悬细胞，转移至 1.2 ml 微量滴定管中。
- 用额外的 100 µl 含 0.5 µg/ml PI 的染色缓冲液洗涤各孔，并将洗液与前述 200 µl 液体合并至 1.2 ml 微量滴定管中。最终获得 300 µl 染色细胞悬液。
6. 流式细胞术分析
- 使用传统的三激光系统（紫色、蓝色和红色激光）时，应避免使用PE、PerCP-Cy5.5、BV510和PI染料，因为这些染料会受到极强荧光AF488颗粒的显著溢出干扰。建议增加第四根（黄色）激光以优化本实验方案，因为该配置允许使用PE标记的抗体以及将PI染料检测通道由PerCP-Cy5.5通道转移至mCherry通道（图2）。
注意：若无黄色激光，可在其他通道中使用死细胞排除染料。
- 对PI阴性细胞（PI-）设门，以排除死细胞（图2B）。
- 在排除死细胞后，对CD11b阳性细胞（CD11b+）设门，该群包含所有髓系细胞（图2C）。
- 在CD11b+细胞群中，进一步对Ly6C-/Ly6G-细胞设门，以排除中性粒细胞（CD11b+/Ly6G+）和单核细胞（CD11b+/Ly6C+；图2D）。将小胶质细胞定义为CD11b+/Ly6C-/Ly6G-（为简化起见），此时应可观察到两个明显不同的细胞群：一个为荧光标记颗粒阴性，另一个为阳性。吞噬性细胞已摄取颗粒，因此表现为AF488+（图2E）。
注意：也可分析Ly6C阳性或Ly6G阳性细胞群，以利用此染色方法检测颗粒摄取情况。吞噬性CD11b+细胞的比例与吞噬性小胶质细胞的比例具有良好的相关性（图2F）。对于无流式细胞术经验的研究人员，可仅通过CD11b染色进行更简单的分析，但该方法会同时包含吞噬性中性粒细胞、单核细胞及小胶质细胞。在CD11b+/Ly6C-/Ly6G-细胞群中，根据F4/80和CX3CR1标志物染色判断，这些细胞> 99%为小胶质细胞；这些标志物可添加使用，但在我们实验中并非必需。
