本文描述了一种用于研究在恐惧条件反射过程中支持意识性与无意识性记忆机制的神经基础的方法。该方法通过监测经典条件性恐惧范式中的血氧水平依赖（BOLD）功能磁共振成像、皮肤电导反应以及非条件刺激预期程度，以评估不同记忆过程的神经相关性。
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摘要
摘要
在人类中，经典条件恐惧范式常与功能磁共振成像（fMRI）结合使用，以研究联想学习的神经基础1-5。在这些研究中，提供条件反射的行为学证据非常重要，以验证脑活动的差异确实与学习相关，并与人类行为相一致。
恐惧条件反射研究通常监测自主神经反应（例如皮肤电导反应；SCR）作为学习与记忆的指标6-8。此外，其他行为测量也可提供有关学习过程和/或影响条件反射的其他认知功能的有价值信息。例如，无条件刺激（UCS）预期对条件反应（CR）和无条件反应（UCR）表达的影响，已成为近年来多项研究的关注主题9-14。最近，皮肤电导反应（SCR）与UCS预期测量已结合功能性磁共振成像（fMRI）用于探究意识性与无意识性恐惧学习及记忆过程的神经基础15。尽管这些认知过程可在一定程度上于条件反射训练结束后进行评估，但训练后的评估无法逐 trial 地测量预期，且易受到干扰、遗忘以及其他可能扭曲结果的因素的影响16,17。
在功能性磁共振成像（fMRI）过程中同步监测自主神经反应和行为反应，为评估介导认知过程与行为/自主神经反应之间复杂关系的神经基础提供了有效手段。然而，在MRI环境中监测自主神经和行为反应会带来若干实际问题。具体而言：1）标准的行为学和生理监测设备通常由铁磁性材料制成，无法在MRI扫描仪附近安全使用；2）当此类设备置于MRI扫描室外部时，连接受试者的电缆可能引入射频噪声，导致脑图像中出现伪影；3）扫描过程中梯度切换可能在皮肤电导信号中产生伪影；4）行为反应所涉及的运动负荷引发的fMRI信号，可能需要与感兴趣的认知过程相关的大脑活动相区分。上述每一项问题均可通过调整生理监测设备的配置以及增加数据处理分析步骤加以解决。本文介绍一种在fMRI期间同步监测自主神经和行为反应的方法，并展示如何利用这些方法研究恐惧条件反射过程中的意识依赖性与无意识记忆过程。
方案
1. 心理生理学
Biopac Systems, Inc. 生理监测系统（参见特定设备列表）在大多数影像中心并非标准设备。应在受试者到达前预留15-30分钟，用于安装本方案中所述的生理监测设备及其他相关设备（图1）。
- 使用标准以太网交叉电缆（CBLETH2）将运行 AcqKnowledge（Biopac Systems, Inc.）生理监测软件的控制室计算机连接到 Biopac MP150（MP150WSW）设备。
- 使用 DB25 公/母带状电缆将 Biopac 隔离数字接口（STP100C）连接到运行 Presentation（Neurobehavioral Systems, Inc; Albany, CA）软件的控制室计算机。
- 在控制室内，使用屏蔽延长电缆（MECMRI-3）将 Biopac 皮肤电反应放大器（EDA-100C-MRI）连接至射频干扰滤波器（MRIRFIF）。
- 在磁共振成像（MRI）扫描室内，将射频干扰滤波器（MRIRFIF）连接至屏蔽延长电缆（MECMRI-1）。
- 将屏蔽延长电缆连接至碳纤维导联线（LEAD 108），后者连接至射频透光电极（EL508）。注意：将导联线紧密绞合成螺旋状，可减少扫描过程中皮肤电导数据中可能产生的伪迹。
- 将射频透光电极（EL508）贴附于受试者左手的中指和无名指末节指骨处。
- 由于扫描设备的特性，磁共振成像（MRI）室内的温度通常设定在 21°C 以下。应使用毯子覆盖受试者，以维持其手部温度。
2. 行为反应（操纵杆）
- 使用 USB-mini 电缆将运行 Presentation 软件（Neurobehavioral Systems, Inc；Albany, CA）的控制室计算机连接到操纵杆的 fORP 接口单元（Current Designs, Inc；Philadelphia, PA）。
- 在控制室内将光纤电缆连接至 fORP 接口单元，然后将电缆通过波导管引入 MRI 扫描室。
- 将光纤电缆连接到与 MRI 兼容的操纵杆上。
- 指导受试者将操纵杆放置在舒适且易于触及的位置。
3. 刺激呈现
- 将运行 Presentation 软件的控制室计算机连接到 IFIS-SA（Invivo 公司，奥兰多，佛罗里达州）控制台的外部 VGA 和音频端口（图 1）。
- 检查 IFIS 控制台与 MRI 扫描室内 IFIS 外围接口单元之间的光纤电缆连接，以及外围接口单元与音视频显示单元之间的连接。
- 将音视频显示单元放置在头线圈后方，使受试者可通过头线圈上附带的反射镜观看显示器。
- 使用乙烯基管将音视频显示单元的声学接口盒连接至 IFIS 系统的磁共振兼容立体声耳机。
- 使用声压级计校准听觉刺激的音量。
4. 实验步骤
- 告知参与者，在研究过程中将多次呈现两个音调，且音调的音量会在其感知阈值上下波动（图2）。
- 指示参与者一旦听到任一音调，立即按下操纵杆盒上的按钮，随后通过移动操纵杆来调整0到100量表上评分条的位置，以更新其对无条件刺激（UCS）出现的预期（图3）。
- 指导参与者在0到100的连续量表上对其UCS预期程度进行评分。告知他们，评分为0表示确定不会呈现UCS，评分为50表示不确定是否会呈现UCS，评分为100表示确定会呈现UCS。指导参与者使用量表上的其他数值表示不同程度的中间预期。随后，让参与者练习使用操纵杆进行评分。
- 采用两种音调（700 Hz和1300 Hz；持续时间10秒；刺激间间隔20秒）作为条件刺激（CS），以高强度白噪声（100 dB，500毫秒）作为无条件刺激（UCS），对参与者实施差异性恐惧条件化程序。
- 以伪随机顺序呈现60次CS+（与UCS同时结束）和60次CS-（不伴随UCS呈现），确保相同CS的连续试验不超过两次。
- 在不同参与者之间交叉平衡用作CS+和CS-的音调。
- 独立调节CS+和CS-的音量。在下一次相同CS的试验中调整CS音量：若参与者按下按钮（即感知到该次刺激），则音量降低5 dB；若未按下按钮（即未感知到该次刺激），则音量增加5 dB。
5. 扫描程序
- 采集标准的高分辨率T1加权结构像（例如MPRAGE），作为功能数据的解剖学参考。
- 在条件化过程中采集全脑的BOLD fMRI数据。采用相对标准的成像参数（例如TR = 2000ms，TE = 30ms，FOV = 24cm，64×64矩阵），采集36层、每层厚度为4mm的图像即可充分覆盖大脑。使用fMRI触发盒将fMRI数据采集与刺激呈现同步。
6. SCR 数据采集与分析
- 使用第1节中描述的AcqKnowledge软件和MR兼容的Biopac生理监测系统，以2,000 Hz的采样率采集皮肤电导数据。
- 对皮肤电导数据应用1 Hz的无限脉冲响应（IIR）数字低通滤波器，以减少成像过程中产生的伪影（见图4）。
- 将皮肤电导数据重采样至250 Hz。
- 通过计算从反应起始到反应峰值期间皮肤电导水平的变化差值，得出皮肤电反应（SCR）。
- 在进行统计分析前，可对SCR数据进行平方根转换，以使反应幅度的分布趋于正态化。
7. UCS 期望数据采集与分析
- 使用 Presentation 软件对样本（40 Hz）进行采样并记录 UCS 期待值数据。
- 将 UCS 期待值计算为 CS 呈现最后 1 秒期间的平均（1 秒样本）反应。
8. 功能磁共振成像数据采集与分析
- 使用功能成像分析软件包（例如 AFNI 18）对脑成像数据进行标准预处理（如层时间校正、图像配准、空间平滑）。
- 为 CS+ 和 CS− 的觉察与未觉察试验以及 UCS 创建标准的干扰变量（如运动）和基于刺激的回归量。
- 创建基于运动反应的参考波形，作为干扰回归量，以校正与按键反应相关的运动活动。
- 创建一个脉冲函数，用于编码按键反应的时间点。
- 将按键脉冲函数与标准血流动力学响应函数（HRF）进行卷积。
- 创建基于运动反应的参考波形，作为干扰回归量，以校正与操纵杆反应相关的运动活动。
- 创建一个脉冲函数，用于编码 UCS 期待评分斜率变化的时间点（例如斜率绝对值 > 10）。
- 将操纵杆斜率脉冲函数与标准 HRF 进行卷积。
- 使用所有基于刺激和干扰变量的回归量进行第一水平分析。
- 进行第二水平的重复测量方差分析，以识别在哪些脑区激活表现出 CS 类型的主效应、知觉的主效应，或 CS 类型与知觉的交互效应。
9. 代表性结果：
本方法通常在受试者感知到 CS+ 的试验中产生相对较高的 UCS 期望评分，而在感知到 CS- 的试验中产生较低的评分（图 5）10,15,19。此类结果表明，受试者能够意识到 CS 与 UCS 之间的关联性。在未被感知的试验中，UCS 期望评分通常与 CS 呈现前的基线评分无明显变化。这些未被感知的 CS+ 和 CS- 试验中的 UCS 期望评分通常接近 50，表明受试者无法确定 UCS 是否会出现10,15,19（图 5）。这种在未被感知的 CS+ 与 CS- 之间无法产生差异性 UCS 期望评分的现象，说明受试者在未被感知的条件化试验中无法表达其对关联性的意识（图 6）。相比之下，在感知和未被感知的条件化试验中均观察到了与学习相关的皮肤电导反应（SCR）变化10,15,19。具体而言，对感知到的 CS+ 的 SCR 明显大于对感知到的 CS- 的反应。同样，在未被感知的 CS+ 试验中的 SCR 也大于未被感知的 CS- 试验10,15,19（图 6）。综合来看，这些行为和自主神经数据表明，在感知到的试验中发生了伴随关联意识的恐惧条件化，而在未被感知的试验中则发生了无关联意识的恐惧条件化。采用该方法的功能影像学研究显示，在感知到的条件化试验中存在与学习相关的海马激活，但在未被感知的试验中则未观察到此类激活15（图 7）。相反，杏仁核的差异性活动在感知和未被感知的条件化试验中均有发现15。这些发现支持如下观点：海马参与支持与关联意识相关的认知过程，而杏仁核则在有无意识的情况下均支持条件反应（CR）的表达。
图1. 刺激呈现及行为/心理生理反应监测的基本设备示意图。使用Presentation软件呈现视听刺激，并通过右手移动操纵杆来记录对非条件刺激（UCS）预期程度的评分。使用AcqKnowledge软件和Biopac设备监测左手的皮肤电导反应。实线（Biopac）、单虚线（IFIS视听系统）和双虚线（光纤操纵杆）表示不同刺激呈现与反应监测系统的连接线缆。黑色箭头表示信息流向。
图 2. 条件刺激。以伪随机顺序呈现CS+和CS-，确保相同条件刺激的连续试验不超过2次。独立调节CS+和CS-的音量。若受试者感知到条件刺激（通过按键表示），则在下一次相同条件刺激的试验中将其音量降低5 dB；若受试者未感知到条件刺激（无按键反应），则在下一次相同条件刺激的试验中将其音量升高5 dB。
图3. UCS预期评分尺度。指导参与者在0至100的量表上对其预期UCS呈现的程度进行评分。评分为0表示确定不会呈现UCS，评分为100表示确定会呈现UCS，评分为50表示对是否呈现UCS感到不确定。应使用中间评分来表示UCS预期程度的渐变差异。
图 4. 原始与滤波后皮肤电导数据的比较。a) 功能磁共振成像（fMRI）期间采集的原始皮肤电导数据。b) 应用1 Hz IIR低通滤波器后的皮肤电导数据。
图 5. UCS 期待值评分。— 参与者在感知到的 CS+ 试验中通常报告较高的 UCS 期待值，在感知到的 CS− 试验中报告较低的期待值。在未感知到的 CS+ 和 CS− 试验中，UCS 期待值无显著差异。
图 6. UCS 期待性与皮肤电反应（SCR）。在感知到的 CS+ 和 CS- 试验中，通常可观察到 UCS 期待性的差异，表明参与者能够意识到刺激之间的关联性。而在未感知到的试验中，UCS 期待性评分通常无显著差异，表明参与者无法表达其对关联性的觉察。相比之下，条件化的皮肤电反应（SCR）差异通常在感知和未感知的条件化试验中均可观察到。此类结果反映了在有（即在感知试验中）和无（即在未感知试验中）关联意识的情况下均存在习得性恐惧表达。
图7. 海马体和杏仁核的功能性磁共振成像。在可感知的条件化试验中，海马体对CS+的反应通常大于对CS-的反应；但在不可感知的条件化试验中则无此差异。而在可感知和不可感知的条件化试验中，通常均可观察到杏仁核的差异性反应。这些发现支持以下观点：海马体参与与条件关联意识相关的加工过程，而杏仁核则在有无意识的情况下均参与恐惧表达。
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讨论
本文所述的恐惧条件反射方法为研究意识层面和无意识层面的恐惧记忆神经机制提供了一种手段。该方法的优势在于能够同时监测行为、自主神经反应以及功能性磁共振成像（fMRI）数据。监测行为反应（即非条件刺激预期，UCS expectancy）和自主神经反应（即皮肤电导反应，SCR）是该方法的关键组成部分。UCS预期可用于评估被试对刺激关联的意识觉知，而SCR则反映了条件反应（CR）的表达水平。结合这两种行为与自主神经反应指标，可在呈现阈上和阈下条件刺激（CS+ 和 CS-）试验时，研究有无关联意识参与的恐惧条件反射过程。随后可利用功能磁共振成像数据，探究意识与无意识恐惧记忆过程的神经相关性。该方法的一个显著优势在于，每位参与者均会经历所有类型的条件反射试验（即被感知的 CS+ 与 CS-，以及未被感知的 CS+ 与 CS-）。像本文所述的这种被试内设计，相较于被试间设计具有更高的统计效能，原因在于个体间的皮肤电导反应（SCR）和fMRI信号反应存在较大的变异性。该方法的另一优点是，条件刺激（CS）的呈现强度会根据每位参与者的知觉阈值进行个性化调整。此外，在整个条件反射过程中，允许知觉阈值发生动态变化。以往研究通常以固定强度在阈值以下呈现刺激
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由阿拉巴马大学伯明翰分校教师发展资助计划提供支持。
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参考文献
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