哺乳动物细胞中重组抗体的制备与纯化

摘要

来源：Shivange, Gururaj, 等 分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤和组织中的分布。J. Vis. Exp.(2020)。

该视频讲解了在哺乳动物宿主细胞中产生抗体的过程，从基因表达到分泌。该过程包括转录、翻译、信号识别、正确折叠，以及最终通过分泌囊泡释放到细胞外介质中。

方案

1. 抗体的表达与纯化

1. CHO细胞的培养与维护
   1. 在37 °C、130 rpm振荡、5% CO₂条件下，于添加了市售1x谷氨酰胺补充剂的FreeStyle CHO培养基中培养CHO细胞₂ 使用德隆氏锥形瓶，可选用玻璃或一次性材质。
      注意： 建议使用带挡板的锥形瓶并配以通气盖，以增强振荡时的扰动并改善气体交换。使用普通锥形瓶（无挡板）时，由于悬浮培养液的扰动受限，抗体产量显著降低。
   2. 将细胞数量维持在1-5 × 10⁶ 细胞/毫升，用 >95% 细胞活力。如果细胞数量超过 5 x 10⁶ 个细胞/毫升时，进行细胞传代。切勿让CHO细胞密度低于0.2 × 10⁶ cells/mL
2. CHO细胞转染
   1. 在200 mL培养基中培养CHO细胞（2 × 10⁶ 细胞/mL）置于带有挡板的德隆氏锥形瓶中。
      注意： 在带挡板的锥形瓶中培养的悬浮细胞，其蛋白产量始终高于在无挡板的锥形瓶中培养的细胞。
   2. 在15 mL离心管中，加入5 mL CHO FreeStyle培养基，再加入50 μg V....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FreeStyle CHO 培养基	Gibco Life Technologies	Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 15240-062
防结块剂	Gibco Life Technologies	Cat # 01-0057DG
BD 胰岛素注射器	BD BioSciences	Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum	PerkinElmer	Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
Cy5 标记的抗人 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 35050-061
HiPure 质粒大提试剂盒	Invitrogen	Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe 层析柱	GE Healthcare	Cat # 11-0034-93
异氟烷，USP	Covetrus	Cat # 11695-6777-2
润滑性眼膏	Refresh Lacri-Lube	Cat #4089
PEI 转染试剂	Thermo Fisher	Cat # BMS1003A
实验模型：细胞系
人：OVCAR-3	美国模式培养物集存库（ATCC）	ATCC HTB-161
人：CHO-K 细胞	本实验室稳定转染获得	ATCC CCL-61
小鼠：4T1	由美国弗吉尼亚大学 Dr. Chip Landen 惠赠
小鼠：MC38	由美国马里兰大学巴尔的摩县分校 Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg 惠赠	通过 STR 分型鉴定