哺乳动物细胞中重组抗体的制备与纯化

摘要

来源：Shivange, Gururaj, 等 分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤和组织中的分布。J. Vis. Exp.(2020)。

该视频讲解了在哺乳动物宿主细胞中产生抗体的过程，从基因表达到分泌。该过程包括转录、翻译、信号识别、正确折叠，以及最终通过分泌囊泡释放到细胞外介质中。

方案

1. 抗体的表达与纯化

1. CHO细胞的培养与维护
   1. 在37 °C、130 rpm振荡、5% CO₂条件下，于添加了市售1x谷氨酰胺补充剂的FreeStyle CHO培养基中培养CHO细胞₂ 使用德隆氏锥形瓶，可选用玻璃或一次性材质。
      注意： 建议使用带挡板的锥形瓶并配以通气盖，以增强振荡时的扰动并改善气体交换。使用普通锥形瓶（无挡板）时，由于悬浮培养液的扰动受限，抗体产量显著降低。
   2. 将细胞数量维持在1-5 × 10⁶ 细胞/毫升，用 >95% 细胞活力。如果细胞数量超过 5 x 10⁶ 个细胞/毫升时，进行细胞传代。切勿让CHO细胞密度低于0.2 × 10⁶ cells/mL
2. CHO细胞转染
   1. 在200 mL培养基中培养CHO细胞（2 × 10⁶ 细胞/mL）置于带有挡板的德隆氏锥形瓶中。
      注意： 在带挡板的锥形瓶中培养的悬浮细胞，其蛋白产量始终高于在无挡板的锥形瓶中培养的细胞。
   2. 在15 mL离心管中，加入5 mL CHO FreeStyle培养基，再加入50 μg VH克隆DNA和75 μg VL克隆DNA。涡旋充分混匀。
   3. 将DNA混合物在室温下孵育5分钟。
      注意： 孵育时间延长会降低蛋白质产量。
   4. 向DNA溶液中加入750 μL的1 mg/mL聚乙烯亚胺（PEI）储备液，剧烈涡旋混合30秒。室温下再孵育5分钟。
      注意： PEI 必须新鲜配制。多次冻融循环会显著降低总体得率。
   5. 将DNA与PEI的全部混合物加入细胞中，同时手动轻轻摇动烧瓶。立即将含有细胞的德隆式带挡板锥形瓶置于37 °C、130 rpm振荡培养。
3. 表达
   注意：该抗体的N端含有经基因工程改造的分泌信号肽，有助于抗体分泌到培养基中。
   1. 将转染的细胞在第1天于37 °C、130 rpm振荡条件下培养。
   2. 第2天，加入2 mL 100倍抗团聚剂和2 mL 100倍抗菌-抗真菌溶液。将培养瓶转移至较低温度（32–34 ˚C）环境中，以130 rpm振荡培养。
   3. 每五天添加 10 mL 胰蛋白胨 N1 培养基和 2 mL 100 倍谷氨酰胺补充剂。
   4. 每三天使用血细胞计数板对台盼蓝染色后的细胞悬液进行一次细胞计数，确保细胞活力保持在80%以上。
   5. 第10或11天，收集培养基用于抗体纯化。将培养物在3000 × g离心 x g4 °C 下孵育 40–60 分钟，然后使用 0.22 µm 瓶式滤器过滤澄清的培养基。
4. 纯化
   注意： 使用市售的Protein-A柱进行抗体纯化（参见 材料表），使用蠕动泵。
   1. 用两倍柱体积的结合缓冲液（pH 7.4 的 20 mM 磷酸钠）平衡层析柱。
   2. 以1 mL/min的流速将含有抗体的滤过培养基（步骤1.3.5中获得）通过层析柱。
   3. 用两倍柱体积的结合缓冲液洗涤柱子。
   4. 使用5 mL洗脱缓冲液（pH 3.4的30 mM醋酸钠）将抗体洗脱至500 μL的组分中。
   5. 通过向每份洗脱抗体中加入10 μL中和缓冲液（pH 9的3 M醋酸钠）来中和其pH值。
      注意： 第3至6号组分中含有大部分抗体。建议保留所有组分，以防抗体洗脱时间晚于预期，出现在后续组分中。
   6. 使用分光光度计，选择IgG的默认检测程序测定纯化抗体的浓度。通过考虑分子量和吸光系数，获得抗体的最终浓度，单位为mg/mL。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FreeStyle CHO 培养基	Gibco Life Technologies	Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 15240-062
防结块剂	Gibco Life Technologies	Cat # 01-0057DG
BD 胰岛素注射器	BD BioSciences	Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum	PerkinElmer	Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
Cy5 标记的抗人 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 35050-061
HiPure 质粒大提试剂盒	Invitrogen	Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe 层析柱	GE Healthcare	Cat # 11-0034-93
异氟烷，USP	Covetrus	Cat # 11695-6777-2
润滑性眼膏	Refresh Lacri-Lube	Cat #4089
PEI 转染试剂	Thermo Fisher	Cat # BMS1003A
实验模型：细胞系
人：OVCAR-3	美国模式培养物集存库（ATCC）	ATCC HTB-161
人：CHO-K 细胞	本实验室稳定转染获得	ATCC CCL-61
小鼠：4T1	由美国弗吉尼亚大学 Dr. Chip Landen 惠赠
小鼠：MC38	由美国马里兰大学巴尔的摩县分校 Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg 惠赠	通过 STR 分型鉴定