测量HA抗体介导的Fc效应功能的激活

摘要

来源：Bailey, M. J.，等。一种评估流感血凝素特异性抗体诱导的Fc介导效应功能的方法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种检测抗体介导的T细胞效应功能激活的实验方法。将针对流感病毒血凝素（HA）的特异性单克隆抗体加入表达HA的转染哺乳动物细胞中，可形成与HA的免疫复合物。当引入表达Fc受体和荧光素酶报告基因的工程化T细胞后，抗体-HA复合物可激活T细胞，通过添加荧光素酶底物并检测产生的生物发光信号，即可检测T细胞的激活程度。

方案

1. 通过转染表达流感病毒血凝素

1. 将人胚胎肾（HEK 293T）细胞以每孔 2 × 10⁴ 个细胞的密度接种于白色组织培养处理的 96 孔板中，并在 37 °C 培养箱（含 5% CO₂）中静置 4 小时。
2. 每孔使用 100 ng 编码病毒血凝素的 DNA 和 0.2 μL 转染试剂，在总体积为 50 μL 的条件下转染细胞。
   注意：质粒和转染试剂均用 1× Opti-最低必需培养基（MEM）减血清培养基稀释。
3. 在 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 18 小时后，移除转染培养基。

2. 通过单克隆抗体或血清评估FcRg/NFAT介导的荧光素酶活性激活

1. 首先，将转染细胞的培养基更换为 25 µL 检测培养基（含 4% (vol/vol) 低 IgG 胎牛血清的 1× RPMI 1640 培养基）。
2. 在另一个 96 孔板中，使用检测培养基将目标抗体从 30 μg/mL 开始进行四倍系列稀释。每个浓度设置三个复孔，示例板布局见图 1A。确保包含不含抗体的对照（无抗体对照）和背景对照（仅检测缓冲液）。
   注意：对于“无抗体”对照和背景对照，应加入 25 µL 检测缓冲液而非抗体。
3. 将步骤 2.2 中系列稀释的抗体各 25 μL 转移至转染细胞板中对应的孔。
4. 将板置于 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 15 分钟。
5. 每孔加入 25 μL 表达小鼠 FcgRIV 或人 FcgRIIIa 的改良效应 Jurkat 细胞（75,000 个细胞/孔）。每孔总体积应为 75 µL，抗体的起始终浓度为 10 µg/mL（图 1B）。
   注意：对于背景对照，加入 25 µL 检测缓冲液而非效应细胞。若需检测抗体依赖性细胞介导的吞噬作用，可使用表达人 FcgRIIa 的改良 Jurkat 细胞。
6. 将板置于 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 6 小时。
7. 使用前约 1 小时，将荧光素酶底物缓冲液在 37 °C 水浴中解冻并预热。
   注意：配制荧光素酶底物缓冲液时，将冻干的荧光素酶检测试剂溶解于提供的检测缓冲液中。配制后的底物缓冲液可在 -30 °C 至 -10 °C 条件下保存最多六周。
8. 除背景对照孔外，其余各孔均加入 75 μL/孔的荧光素酶底物缓冲液。
9. 使用化学发光仪读数。
10. 按以下公式计算诱导倍数：诱导倍数 = (诱导值 - 背景值) / (无单抗值 - 背景值)。

结果

图1：实验分组的平板布局及组成的示意图。（A）每种抗体样品的起始浓度为 10 µg/mL，在平板上从第1列到第12列进行4倍系列稀释。每个样品设三个重复。G行保留用于无单抗对照，H行为背景对照。（B）在加入荧光素酶底物缓冲液之前，各实验组的终体积为 75 µL。需要注意的是，样品组和“无单抗组”中加入 25 µL 效应细胞，而背景对照组中加入 75 µL 检测培养基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-3216	人胚胎肾细胞
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019	转染试剂
1X Opti-MEM 低血清培养基	ThermoFisher Scientific	51985-034
白色组织培养处理的 96 孔板	Corning, Inc.	3917	检测用板
10X MEM	Gibco	11430-030
表达小鼠 FcgRIV 的 Jurkat 细胞	Promega	M1201	试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清
表达人 FcgRIIIa 的 Jurkat 细胞	Promega	G7010	试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清
表达人 FcgRIIa 的 Jurkat 细胞	Promega	G9901	试剂盒包含细胞、Bio-Glo 荧光素酶检测系统、1X RPMI 及低 IgG 血清
光度计	BioTek	Synergy H1 Multi-Mode reader	发光板读数仪
Bio-Glo 荧光素酶检测系统	Promega	G7940	包含荧光素酶检测缓冲液和荧光素酶检测底物