生成流感病毒对中和抗体的逃逸变体

摘要

来源：Leon, P. E., 等 中和性流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的制备 J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种用于生成中和性流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的技术。将抗体中和后的病毒悬液接种至鸡胚中，以选择性扩增逃逸变异株。由此获得的病毒群体主要为逃逸变异株，其存在经测序验证 通过 血凝试验

方案

注意：特异性针对HA的抗体通常可分为两类：i）结合于球状头部顶端受体结合位点上或其邻近区域的抗体；ii）结合于远离受体结合域的抗体，包括球状头部侧面及HA茎部区域的抗体。靶向受体结合位点的抗体可阻止靶细胞表面唾液酸基序的结合，可通过血凝抑制（HI）实验进行检测。HI实验呈阴性的抗体（如特异性针对茎部的抗体）仍可能抑制病毒复制，但只能通过中和实验进行评估。

1. 基于HI活性对抗体进行分类

1. HI 检测
   1. 在 96 孔 V 型底板中，向第 2 至第 12 列各加入 25 µL 的 1× PBS。
   2. 将单克隆抗体（mAb）7B2（头部特异性）、6F12（茎部特异性）以及同型对照用 1× PBS 稀释至 100 µg/mL，并将稀释后的抗体溶液各取 50 µL 分装至第 1 列。同时，通过向一孔中加入 50 µL 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）设置无 mAb 对照（图 1A）。
   3. 通过将 25 µL 液体从第 1 列转移至第 2 列，依次进行 2 倍系列稀释，直至最后一列。从第 12 列弃去最后 25 µL （图 1A）。
      注意：请确保设置一排无抗体对照。
   4. 将病毒储备液（一种重配病毒，表达 A....

结果

图 1：HI 试验。 （A）使用 96 孔 V 型底板建立 HI 试验的示意图，用于检测两种小鼠 H1 特异性单克隆抗体 7B2（头部特异性）和 6F12（茎部特异性）的活性；（B）HI 试验结果示例

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Falcon 96孔透明V型底板	Corning, Inc.	353263	用于血凝抑制试验的检测板
96孔V型底板	Nunc	249662	用于血凝试验的检测板
鸡红细胞	Lampire Biological Laboratories	7201403	用于评估流感病毒凝集能力
重配株 A/California/04/09 (H1)	Palese Laboratory		表达 A/California/04/09 (H1N1) 的 HA 和 NA 蛋白，并携带 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 内部基因片段的重配病毒
重配株 A/Shanghai/1/13 (H7)	Palese Laboratory		表达 A/Shanghai/1/13 (H7N9) 的 HA 和 NA 蛋白，并携带 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 内部基因片段的重配病毒