生成流感病毒对中和抗体的逃逸变体

摘要

来源：Leon, P. E., 等 中和性流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的制备 J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种用于生成中和性流感病毒单克隆抗体逃逸变异株的技术。将抗体中和后的病毒悬液接种至鸡胚中，以选择性扩增逃逸变异株。由此获得的病毒群体主要为逃逸变异株，其存在经测序验证 通过 血凝试验

方案

注意：特异性针对HA的抗体通常可分为两类：i）结合于球状头部顶端受体结合位点上或其邻近区域的抗体；ii）结合于远离受体结合域的抗体，包括球状头部侧面及HA茎部区域的抗体。靶向受体结合位点的抗体可阻止靶细胞表面唾液酸基序的结合，可通过血凝抑制（HI）实验进行检测。HI实验呈阴性的抗体（如特异性针对茎部的抗体）仍可能抑制病毒复制，但只能通过中和实验进行评估。

1. 基于HI活性对抗体进行分类

1. HI 检测
   1. 在 96 孔 V 型底板中，向第 2 至第 12 列各加入 25 µL 的 1× PBS。
   2. 将单克隆抗体（mAb）7B2（头部特异性）、6F12（茎部特异性）以及同型对照用 1× PBS 稀释至 100 µg/mL，并将稀释后的抗体溶液各取 50 µL 分装至第 1 列。同时，通过向一孔中加入 50 µL 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）设置无 mAb 对照（图 1A）。
   3. 通过将 25 µL 液体从第 1 列转移至第 2 列，依次进行 2 倍系列稀释，直至最后一列。从第 12 列弃去最后 25 µL （图 1A）。
      注意：请确保设置一排无抗体对照。
   4. 将病毒储备液（一种重配病毒，表达 A/California/04/09 的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），其内部基因片段来自 A/Puerto Rico/8/34）稀释至 8 血凝单位/25 µL。向每孔（A 至 G 行）加入 25 µL 稀释后的病毒储备液（8 血凝单位）。
      注意：抗体与病毒混合液的终体积应为 50 µL，抗体起始终浓度为 50 µg/mL。
   5. 将板在室温（RT）下孵育 45 分钟。
   6. 对于反向滴定行（H 行），在 H2 至 H12 孔中各加入 50 µL 的 1× PBS。在 H1 孔中加入 100 µL 的 8 血凝单位/25 µL 病毒液。通过从 H1 向 H2 转移 50 µL，依次进行 2 倍系列稀释，依此类推。从 H12 孔弃去最后 50 µL。最后，向 96 孔 V 型底板的所有孔中各加入 50 µL 的 0.5% 鸡红细胞（RBC）。
      注意：检测中的 mAb 样品最终体积应为 100 µL：mAb（25 µL）、病毒（25 µL）和 RBC（50 µL）。无 mAb 对照的最终体积应包含 25 µL 的 1× PBS、25 µL 病毒和 50 µL RBC。
   7. 将板在 4 °C 下孵育 1 小时。
   8. 肉眼观察板上 HI 活性结果。若某一抗体呈阳性反应，则进入步骤 2.1 以生成逃逸突变株。若抗体 HI 检测为阴性，则进入下文步骤 1.2，评估该抗体是否在细胞培养实验中具有中和活性。
      注意：HI 活性阳性的 mAb 表现为孔底中央形成深红色红细胞沉淀 （图 1B；7B2），当将 96 孔 V 型底板倾斜至 45° 角时，沉淀呈泪滴状。阴性结果则不会在孔内形成深红色红细胞沉淀（图 1B；6F12 和无 mAb 对照）。同型对照也不会形成深红色红细胞沉淀，其外观应与茎部特异性抗体 6F12 或无 mAb 对照样本一致 （图 1B）。

2. 逃逸突变体变体的产生

注意：具有或不具有血凝抑制活性的中和抗体将通过下述特定方案进一步分析。

1. 方案1：HI阳性/中和阳性抗体（图2A）​
   1. 在400 µL体积的1×PBS中制备浓度为10⁶ plaque forming units/milliliter（PFU/mL）的病毒储备液。
   2. 在100 µL体积的1×PBS中，配制目标抗体的四种浓度递增的稀释液（例如，0、0.5、0.05 和 0.005 mg/mL）。
      ​注意：野生型病毒应始终在无抗体存在的情况下平行传代。这些传代病毒的序列将有助于区分病毒对细胞培养条件的适应性突变与逃逸突变。
   3. 将100 µL浓度为10⁶ PFU/mL的病毒与100 µL每种抗体稀释液或100 µL的1×PBS混合。
   4. 在37 °C培养箱（含5% CO₂）中孵育1小时，短暂涡旋混匀，然后将每种混合液各200 µL注射入无特定病原体（SPF）的鸡胚中。
   5. 将鸡胚在37 °C（无CO₂）条件下孵育40–44小时。
   6. 将感染病毒的鸡胚在4 °C孵育至少6小时以实施安乐死。
   7. 按前述方法收集鸡胚的尿囊液。
   8. 按上文所述方法进行血凝试验。若所有尿囊液样本均无血凝滴度，则从第2步开始重复实验，抗体稀释浓度范围调整为0.005 mg/mL至0.00005 mg/mL。
      注意：HI阳性抗体的饱和浓度可能中和全部病毒颗粒，因此在传代过程中可能需要降低抗体的用量。
   9. 通过进行HI试验（步骤1.1）确认逃逸变异株。
      注意：HI活性抗体可阻断HA与靶细胞表面唾液酸基序的结合。因此，在对应抗体存在下，病毒失去凝集红细胞的能力（出现红细胞沉淀）。理论上，HI活性抗体的逃逸变异株即使在对应抗体存在下仍能结合唾液酸基序，因而可凝集红细胞（无红细胞沉淀）。若目标抗体的HI效应仍可检测到，则从步骤2.1.2开始重复实验，并提高抗体的起始浓度。

结果

图 1：HI 试验。 （A）使用 96 孔 V 型底板建立 HI 试验的示意图，用于检测两种小鼠 H1 特异性单克隆抗体 7B2（头部特异性）和 6F12（茎部特异性）的活性；（B）HI 试验结果示例

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Falcon 96孔透明V型底板	Corning, Inc.	353263	用于血凝抑制试验的检测板
96孔V型底板	Nunc	249662	用于血凝试验的检测板
鸡红细胞	Lampire Biological Laboratories	7201403	用于评估流感病毒凝集能力
重配株 A/California/04/09 (H1)	Palese Laboratory		表达 A/California/04/09 (H1N1) 的 HA 和 NA 蛋白，并携带 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 内部基因片段的重配病毒
重配株 A/Shanghai/1/13 (H7)	Palese Laboratory		表达 A/Shanghai/1/13 (H7N9) 的 HA 和 NA 蛋白，并携带 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 内部基因片段的重配病毒