针对中和抗体的流感病毒逃逸变异的产生

>注意:抑制病毒复制的 HA 特异性抗体通常可分为 i） 结合在球状头部顶部或受体结合位点附近的抗体，以及 ii） 结合受体结合结构域远端的抗体，包括球状头的外侧和 HA 的柄区域。靶向受体结合位点的抗体会阻止唾液酸基序在靶细胞表面的结合，并且可以使用血凝抑制 （HI） 测定法进行测量。HI 阴性抗体（例如茎特异性抗体）仍然可以抑制病毒复制，但只能使用中和试验进行评估。

1. 根据 HI 活性对抗体进行分类

1. HI 测定
   1. 在 96 孔 V 形底板中，在第 2 至 12 列上添加 25 μL 1x PBS。
   2. 在 1x PBS 中将单克隆抗体 （mAb） 7B2（头部特异性）、6F12（茎特异性）和同种型对照稀释至 100 μg/mL，并将 50 μL 稀释的抗体制剂分装到第 1 列中。此外，通过添加 50 μL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 来加入无 mAb 对照（图 1A）。
   3. 通过将 25 μL 从第 1 柱转移到第 2 柱，对抗体进行 2 倍连续稀释，依此类推。丢弃第 12 列中的最后 25 μL（图 1A><）。 注意:确保包括一行无抗体对照。
   4. 将病毒原液（表达 A/California/04/09 的血凝素 （HA） 和神经氨酸酶 （NA） 的重组病毒，内部片段为 A/Puerto Rico/8/34）稀释至 8 个血凝单位/25 μL 稀释的病毒原液。向每个孔（A 行至 G 行><）中加入 25 μL 稀释的病毒原液（8 次血凝）。 注意:抗体和病毒混合物的最终体积应为 50 μL，起始最终浓度为 50 μg/mL。
   5. 在室温 （RT） 下孵育板 45 分钟。
   6. 对于反向滴定行 （H），在 H2 至 H12 孔上加入 50 μL 1x PBS。向 H1 孔中加入 100 μL 的 8 个血凝单位/25 μL。通过将 50 μL 从 H1 转移到 H2 来连续稀释 2 倍，依此类推。丢弃 H12 孔中的最后 50 μL。最后，将 50 μL 的 0.5% 鸡红细胞 （RBC） 添加到 96 孔 V 形底板的所有孔中><。 注意:检测中的 mAb 样品的最终体积应为 100 μL:mAb （25 μL）、病毒 （25 μL） 和 RBC （50 μL）。无 mAb 对照的最终体积应包含 25 μL 的 1x PBS、25 μL 的病毒和 50 μL 的 RBC。
   7. 将板在 4 °C 下孵育 1 小时。
   8. 目视读取 HI 活动的板。如果特定抗体的读数呈阳性，请继续执行步骤 2.1 以生成逃逸变体。如果抗体为 HI 阴性，请继续执行下面的步骤 1.2，以评估抗体在细胞培养测定中是否具有中和活性><。 注意: HI 活性 mAb 的阳性读数由孔中心的深红色 RBC 沉淀表示（图 1B;7B2），当 96 孔 V 形底板保持 45° 角时，该沉淀将形成泪滴。阴性读数不会在孔中形成深红色的 RBC 沉淀（图 1B;6F12 且无 mAb）。同型对照也不会形成深红色的 RBC 沉淀，看起来应该与茎特异性抗体 6F12 或无 mAb 对照样品相同（图 1B）。

2. 逃逸突变体变体的生成

注意:具有或缺乏 HI 活性的中和抗体使用下述特定方案进行进一步分析。

1. 方案 1:HI 阳性/中和阳性抗体（图 2A）
   1. 在 1x PBS 中制备 10 个⁶ 噬菌斑形成单位/毫升 （PFU/mL） 的病毒原液，体积为 400 μL。
   2. 在 1x PBS 中制备四种浓度递增（例如，0、0.5、0.05 和 0.005 mg/mL）的目标抗体稀释液，每次稀释体积为 100 μL><。 注:野生型病毒应始终平行传代，且无抗体。这些传代病毒的序列将有助于区分对细胞培养条件的适应和逃逸突变。
   3. 将 100 μL 10⁶ PFU/mL 病毒与 100 μL 每种抗体稀释液或 100 μL 1x PBS 混合。
   4. 在 37 °C 培养箱（含 5% CO₂）中孵育 1 小时。短暂地涡旋。将 200 μL 每种混合物注入无特定病原体 （SPF） 的胚胎鸡蛋中。
   5. 将鸡蛋在 37 °C（无 CO₂ ）下孵育 40-44 小时。
   6. 通过在 4 °C 下孵育至少 6 小时来牺牲病毒感染的胚胎卵。
   7. 如前所述，从鸡蛋中收集尿囊液。
   8. 如上所述，进行血凝测定。如果所有尿囊液制剂都没有血凝滴度，则从步骤 2 开始重复，抗体稀释度范围为 0.005 mg/mL 至 0.00005 mg/mL。
      注意: HI 阳性抗体的饱和浓度可以中和存在的所有病毒颗粒。因此，可能需要减少传代中存在的抗体量。
   9. 通过执行 HI 测定（步骤 1.1）确认逃逸变体><。 注意:HI 活性抗体阻断唾液酸基序在靶细胞上的 HA 结合。因此，病毒在其同源抗体存在下失去了凝集 RBC 的能力（存在 RBC 沉淀）。理论上，即使在存在其同源抗体的情况下，HI 活性抗体的逃逸变体仍然可以结合唾液酸基序，因此可以凝集 RBC（无 RBC 沉淀）。如果仍然可以检测到目标抗体的 HI，则使用更高的抗体起始浓度重复步骤 2.1.2 中的方案。

图 1:HI 测定。（A） 使用 96 孔 V 形底板设置 HI 检测以测试两种小鼠 H1 特异性 mAb 7B2（头部特异性）和 6F12（茎特异性）活性的示意图，以及 （B） HI 检测结果示例

图 2:逃逸突变体的生成。建议的方法将取决于 HI 和抗体表现出的微中和活性。针对 （A） 中和 HI 阳性抗体的逃逸突变体的产生可能需要在鸡蛋中进行一次传代，而 （B） 中和 HI 阴性抗体可能涉及细胞组织培养中抗体量增加的多次传代。