从哺乳动物细胞培养中制备重组单克隆抗体

摘要

来源：Nogales-Gadea, G. 等，从永生化分选B细胞生成重组人源IgG单克隆抗体 J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了一种通过将携带重链和轻链基因的质粒载体导入哺乳动物细胞来产生抗体的方法。这些载体与聚乙烯亚胺相互作用，通过形成多聚复合物进入细胞；随后，它们被翻译成单个蛋白质，并组装成完整的抗体，最终分泌到细胞外培养基中。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离

1. 在采血后尽快将25 ml 受试者的肝素抗凝血以900 × g离心15分钟。若血液量较少，应相应减少试剂用量。后续所有步骤均需在生物安全柜中进行。
2. 将血清转移至洁净离心管中。该血清可用于后续步骤中PBMC的冻存，或针对自身免疫性疾病患者用于检测自身抗体。
3. 用10 ml RPMI 1640培养基稀释血液，并通过吹打重悬细胞。
4. 向一个新的50 ml 离心管中加入15 ml 含多蔗糖和泛影酸钠（密度为1.077 g/ml）的溶液。
5. 将步骤1.3中的血液小心地叠加至步骤1.4的溶液上方：将两支离心管管口靠近，使液体缓慢接触，然后缓慢倾注PBMC悬液至50 ml 离心管液面上方。此步骤对实现PBMC的良好分离至关重要。
6. 将步骤1.5所得离心管于室温（RT）下以400 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。
7. 离心结束后，用移液器小心吸取管中段出现的白色环状层，该层含有PBMCs。
8. 用25 ml RPMI 1640培养基洗涤细胞。
9. 于室温下以300 × g离心10分钟。
10. 弃去上清液，用10 ml RPMI 1640培养基重悬细胞并洗涤，再次按照步骤1.9的条件进行离心。
11. 按照既往报道的方法，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对PBMC进行计数。
12. 按第2节所述方法立即处理PBMC，或按以下方法保存以备后续使用：每支冻存管中加入1000万个PBMC，用1 ml 含10%二甲基亚砜（DMSO）和90%步骤1.2中获得的血清的混合液悬浮细胞。逐步降温后长期保存于液氮中。

2. 通过细胞流式术对 PBMC 进行染色以分选 CD22+ 和免疫球蛋白 G (IgG+) 细胞

1. 将PBMC接种于25 cm²培养瓶中² 6 ml 细胞培养瓶 含L-谷氨酰胺、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液、50 U/ml 青霉素，50 µg/ml 链霉素和10%胎牛血清）中，过夜恢复 在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）的培养箱中₂).
2. 用无菌的4%白蛋白磷酸盐缓冲液（PBS）溶液在4°C过夜（O/N）封闭无菌荧光激活细胞分选（FACS）管。用PBS洗涤管子两次，并加入500 µl完全RPMI 1640培养基。分选后用于收集细胞。
3. 将PBMC收集至离心管中，在室温下以400 × g离心5分钟。
4. 用标记缓冲液重悬细胞（见步骤2.5和2.6），并进行细胞计数。标记缓冲液为含2%胎牛血清和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的无菌PBS溶液。
5. 准备3个FACS管，每管中加入10⁵ 每个细胞重悬于100 µl 标记缓冲液。这些试管将用于定义分选门。
   1. 在第一个试管中加入 5 µl 20 µl 抗 CD22 PerCP 抗体（以生产商说明书推荐为准），在第二个试管中加入 20 µl 加入推荐量的抗IgG PE（以制造商数据表为准），第三管中不加任何物质。冰上避光孵育30分钟。
6. 将500万个细胞重悬于200 µl中 FACS管中加入10 µl标记缓冲液 抗CD22 PerCP 和 40 µl 加入抗IgG PE。将细胞置于冰上避光孵育30分钟。若需分选更多细胞，可按比例增加所有试剂用量。
7. 以400 × g离心5分钟，刹车设置为低档 室温下
8. 轻轻倒出上清液。
9. 将细胞重悬于 500 µl 中 加入标记缓冲液。在400 × g离心力下，以低刹车速度离心5分钟 在室温下。重复步骤 2.7 和 2.8
10. 轻轻倒出上清液，并将细胞重悬于 300 µl 中 RPMI 完全培养基
11. 将细胞通过0.45 µm滤器过滤。细胞已准备好进行分选。

3. CD22+ 和 IgG+ B 细胞的分选

1. 使用3个对照管以评估细胞的活力。在未染色的对照管中，利用前向散射光和侧向散射光图确定淋巴细胞的设门范围。CD22 PerCP 和抗 IgG PE 的对照管用于设定设门参数及分选门。操作步骤参照先前已发表的数据。
   注意：设门是一组数值界限（边界），用于从大量细胞流式事件中分离出特定的细胞群体。在分选门的情况下，这些数值界限允许回收位于设定边界内的流式事件，即 CD22+ 和 IgG+ 的细胞。
2. 在分选过程中，使用步骤2.2中获得的含500 µl 完全RPMI 1640培养基的封闭管作为收集管。
3. 开始分选双阳性细胞：CD22+ IgG+。注意记录每种条件下最终获得的细胞数量。尽快将分选后的细胞接种至饲养细胞层上。

4. 饲养细胞的照射

注意：在分选前1至3天进行饲养细胞的制备。每孔96孔圆底培养板至少需要5,000个wi38细胞。步骤4.1、4.2和4.4需在生物安全柜中进行。

1. 在完全 RPMI 1640 培养基（与 PBMC 培养所用相同）中，于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养 wi38 细胞，直至达到所需细胞数量。
2. 按照先前描述的方案，对细胞进行 50 Grays 的辐照。可在 wi38 细胞经胰蛋白酶消化并重悬于完全 RPMI 培养基后进行辐照，也可在细胞仍贴壁于培养瓶时辐照，之后再进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化操作应遵循 wi38 细胞供应商提供的方法。辐照的细胞数量应足以覆盖用于接种 IgG+ B 细胞的孔（即步骤 1.11 中计数的总 PBMC 数量的 1%）。
3. 在 96 孔圆底培养板的每孔中接种 90 µl 含 5,000 个辐照处理的 wi38 细胞的悬液。板的外周行孔保持空置（因其蒸发较快），仅使用板中央的 60 个孔进行细胞接种。在围绕中央孔的外围孔中加入 200 µl PBS 以减少蒸发。
4. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育，直至后续使用。

5. 分选后PBMC的铺板、EB病毒（EBV）感染与培养

1. 将分选后的PBMCs稀释，以每50 µl体系接种50个细胞 每孔加入 RPMI 1640 完全培养基，置于已接种 WI38 照射细胞的 96 圆孔板中。操作步骤需在配备 EBV 操作条件的生物安全柜中进行。 
   注意：每孔接种50个细胞的感染条件已优化，可提高产生单克隆抗体的可能性， 然而，建议按照之前所述方法通过聚合酶链式反应（PCR）进行验证。
2. 加入 60 µl EBV 上清液（含 3 - 4 x 10⁸ 每孔加入病毒拷贝数/ml，加入至96孔圆底培养板的各孔中。 注意 在进行EBV实验操作时应采取相应的防护措施。
3. 加入 1 µg/ml 每孔含 CpG（ODN2006）。
4. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育₂.
5. 一周后在显微镜下观察克隆生长情况。
   注意：B 的一些示例 可在结果部分下方观察到细胞生长情况。请注意，各克隆的生长速率可能存在差异。 会有所不同，可能需要额外时间才能观察到细胞团块在孔中央开始生长。
6. 在1之后^st 两周后在光学显微镜下监测克隆生长情况，并进行首次换液。缓慢用移液器吸取90 µl 从孔的上部吸出培养基，并收集到干净的96孔板中。（B细胞位于孔底，因此吸取时不会吸到细胞）。 
   1. 每孔加入 100 µl 含1 µg/ml补充剂的完全RPMI 1640培养基 CpG（ODN2006）和 50 U/ml 若克隆正在生长，则按照步骤6，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）分析首次换液后的培养基。
7. 监测克隆生长情况，并在第3天后更换培养基^rd 以及 4^th 再次生长的一周，取 90 µl 培养基并加入100 µl 含1 µg/ml补充剂的完全RPMI 1640培养基 CpG（ODN2006）和 50 U/ml 收集上清液，按照步骤6中的方法通过ELISA检测IgG的产生。
   注意一个月后，通过观察圆底孔中央聚集的圆形细胞团，应能明显看到克隆生长。
8. 在此步骤中，以与前几周相同的方式更换培养基，但仅使用完全RPMI 1640培养基。判断更换培养基合适时机的一个良好指标是培养基的颜色：若培养基颜色开始变黄，则说明细胞需要更换培养基。
9. 当96孔板中含有较大的克隆（约5 x 10⁵ 细胞），转移至24孔板的平底孔中，加入300 µl 向新孔中加入完全RPMI 1640培养基。通过反复吹打重悬96孔板中生长的克隆，并将细胞转移至新孔，确保均匀分布。根据需要添加新鲜培养基。
   1. 当24孔板的孔中充满细胞（约5 x 10⁶ 细胞），转移至6孔板的平底孔中，加入2 ml 向新孔中加入完全 RPMI 1640 培养基。用移液器反复吹打混匀 24 孔板中的细胞，使其在新孔中均匀分布。
10. 根据需要添加培养基。若细胞无需继续培养，于室温下以400 × g离心5分钟收集细胞。保留上清液用于ELISA检测。用1 × PBS洗涤细胞沉淀一次，再次以400 × g离心5分钟，将沉淀干燥后于-80 °C保存，直至进行RNA提取。
    1. 当6孔板中的细胞达到汇合状态（约20 × 10⁶个细胞）时⁶ 细胞），转移至60 mm培养皿中，加入4 ml 向新培养板中加入完全RPMI 1640培养基。重悬6孔板中的细胞，并按照步骤5.9和5.10的方法进行转移。
11. 根据需要添加新鲜培养基。在此步骤中，将细胞以每毫升1000万至3000万个的数量进行冷冻保存。 在90%胎牛血清和10% DMSO中。若需要更多细胞，可继续在表面积更大的培养板中扩增克隆。

6. IgG 抗体检测的 ELISA 方法

1. 在 ELISA 板中每孔加入 50 µl 的山羊 F(ab)₂ 1:1000 稀释的抗人 Fc 抗体 200，溶于包被缓冲液中。包被缓冲液含有50 mM碳酸钠（Na₂CO₃) pH 9.6
2. 用塑料封板膜密封，37 °C孵育1小时。或者，4 °C过夜孵育。
3. 每孔用 200 µl 洗涤 6 次 洗涤缓冲液。洗涤缓冲液含有含0.05% Tween-20的1×PBS。切勿触碰或刮伤抗体结合的孔板表面。
4. 用封闭液封闭，每孔100 µl。封闭液为含4%脱脂奶粉的PBS。密封酶标板，37 °C孵育1小时。
5. 不要洗涤。弃去封闭缓冲液，将板倒置在纸巾上轻拍3次，以去除残留液体。
6. 孵育克隆的上清液和标准品。
   1. 初次检测时，将步骤5.6或5.7获得的克隆上清液用RPMI培养基按1:3比例稀释。对于标准品，用人IgG溶液以RPMI培养基进行稀释，得到以下浓度：1,000 ng/ml、500 ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.25 ng/ml、15.6 ng/ml。 以及空白对照。每孔加入50 µl，37 °C孵育60分钟。进一步分析该克隆上清液的不同稀释度（如1/10或1/100）以检测抗体亲和力。
7. 按照步骤6.3的方法进行洗涤。
8. 使用山羊 F(ab)2 抗人 IgG Fc 辣根过氧化物酶偶联物，用孵育缓冲液按 1:20,000 稀释后，每孔加入 50 µl。孵育缓冲液含有 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.02% Tween 20 的 1×PBS 溶液。孵育 37 °C 下孵育 60 分钟。
9. 按照步骤6.3的方法进行洗涤。
10. 每孔加入 100 µl 含 0.1% 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的底物溶液。孵育 10 分钟 直至孔中出现稳定的蓝色为止。注意：切勿等待过久！
11. 加入50 µl终止反应 2 M 硫酸（H₂SO₄）。在30分钟内测定450 nm处的吸光度 反应停止后。
    注意：所有克隆上清液中，若信号值超过空白对照3个标准差，则判定为含有人源IgG抗体阳性。为确认阳性克隆，应在同一克隆的不同上清液中至少重复ELISA检测三次。此外，为排除非特异性交叉反应的可能性，建议验证在未包被但已封闭的孔中孵育上清液时无信号产生。在此步骤中，可在进入第7节之前，进行抗原特异性检测，以筛选目标抗体的抗原特异性。

7. 产生 IgG 克隆的 RNA 分离与第一链互补 DNA (cDNA) 合成

1. 一旦通过 ELISA 确认 IgG 的产生，立即提取该克隆的 RNA。
2. 对于从步骤 5.7 或 5.9 中正在培养的细胞中提取 RNA，使用 superscript III cells direct cDNA 合成试剂盒，该试剂盒可从 10,000 个细胞至单个细胞中获得 cDNA。
3. 对于从较大量细胞或步骤 5.11 中保存的细胞沉淀中提取 RNA，使用 high pure RNA isolation 试剂盒。其他 RNA 提取系统在此步骤中也可能适用。请遵循试剂盒制造商的说明。
4. 对于细胞数量在 1 × 10⁶ 至 1 × 10⁴ 之间的样本，请按照制造商的说明使用逆转录系统。也可使用其他用于第一条 cDNA 链合成的系统。

8. 1^st 和 2^nd 用于扩增IgG产生型B细胞克隆重链和轻链的PCR

1. 使用第5.6和5.7步获得的细胞克隆cDNA，并在第6步IgG ELISA中呈阳性，根据 表1中列出的引物进行PCR。
2. 分别对每条IgG重链、κ轻链和λ轻链设置独立的PCR反应。将正向和反向引物以等浓度配制成储备液，并使其在反应中的终浓度为0.4 µM。
3. 取1 µl cDNA合成产物进行第1^轮 PCR。此处采用20 µl 反应体系，并依照Takara Taq酶生产商的说明书操作。也可使用其他聚合酶。
4. 将第1^轮 PCR置于以下循环条件下：94 °C 预变性5 min；（进行50个循环：94 °C 变性30 sec；58 °C 退火30 sec， 72 °C 延伸45 sec）；72 °C 最终延伸7 min；然后降温至4 °C 保存。反应中需设置空白对照，以检测可能存在的污染。
5. 配制1x TBE缓冲液（89 mM Tris-硼酸和2 mM EDTA）。取100 ml 1x TBE缓冲液，加入1 g琼脂糖（制成1%琼脂糖凝胶），在微波炉中加热约1分钟，直至琼脂糖完全溶解。随后加入4 µl 10 mg/ml 溴化乙锭（或等效DNA染料），混匀。
   1. 将溶液倒入制胶模具，待其完全凝固。取5 µl PCR产物上样电泳，以观察条带。重链片段大小应在400–550 bp左右，轻链片段应在300–400 bp左右。若未检测到条带，则继续进行第2^轮 PCR。
6. 取1 µl 第1轮PCR产物进行第2^轮 PCR。试剂与第8.2步相同，但使用相应的引物组合（见 表1）。第2^轮 PCR的反应条件如下：94 °C 预变性5 min；（进行50个循环：94 °C 变性30 sec；56.5 °C 退火30 sec ，72 °C 延伸55 sec）；72 °C 最终延伸7 min；然后降温至4 °C 保存。反应中需设置空白对照，以检测可能的PCR污染。
7. 按照第8.5步所述方法制备琼脂糖凝胶，并进行电泳以观察PCR产物（同第8.5.1步）。选取含有正确大小片段的扩增产物，用于第9步的克隆及第10步的抗体表达。
8. 进行DNA测序，反应体系为10 µl ，包含：100 ng第2^轮 PCR产物、0.2 µM引物或引物混合物、1 µl 终止子和1 µl 缓冲液。测序反应条件如下：（25个循环：96 °C 变性10 sec；50 °C 退火5 sec；60 °C 延伸4 min）；60 °C 最终延伸7 min；然后降温至4 °C 保存。
9. 按照生产商说明书，使用微柱G50纯化测序反应产物。如前所述，在自动测序仪上分析连接产物的序列。电泳图谱应清晰，且对应单一免疫球蛋白序列。
   注意：若PCR产物显示不清晰或混合的免疫球蛋白序列，请考虑使用TopoTA克隆系统进行克隆，以获得单一序列，然后继续进行第9步。

9. 产生IgG克隆的重链和轻链的克隆与测序

1. 准备 1 µg 的 pFUSE2ss-CLIg-hk、pFUSE2ss-CLIg-hl2 和 pFUSEss-CHIg-hG1 载体 DNA。
2. 用适当的限制性内切酶消化这些载体。使用 生态RI 和 BsipFUSE2ss-CLIg-hk 的 WI 生态RI 和 AvrII 对于 pFUSE2ss-CLIg-hl2，以及 生态RI 和 NheI 对应 pFUSEss-CHIg-hG1。每 1 µg 载体 DNA 使用 3 单位的每种限制性内切酶。
   1. 用一种酶进行消化，并使用PCR纯化试剂盒纯化消化产物。用第二种酶进行消化，然后使用凝胶回收试剂盒（按照制造商说明书）进行纯化。从琼脂糖凝胶中切下目标片段。按照步骤8.5的方法制备琼脂糖凝胶。
3. 消化 2^nd 产生IgG克隆的PCR产物： 生态RI 和 Bsikappa链扩增的WI， 生态RI 和 AvrII 用于 lambda 链扩增，以及 生态RI 和 Nhe重链扩增。先用一种酶进行消化，并使用PCR纯化试剂盒纯化消化产物。再用第二种酶进行消化，并使用PCR纯化试剂盒纯化消化产物。所用酶的单位数和DNA用量与步骤9.2相同。
4. 使用T4 DNA连接酶按照生产商的建议在16 °C下过夜连接PCR片段与载体。所用比例应为1 : 2（载体 : 插入片段）。
5. 使用 1 µl 连接产物转化至DH5α细菌。按照DH5α生产厂家提供的条件进行转化。根据所用载体类型，将细菌涂布于含blasticidin或zeocin的平板上。37 °C过夜培养。
6. 培养单菌落，并按照质粒小提试剂盒说明书提取DNA。使用该DNA小提试剂盒厂商推荐的条件进行单菌落培养和DNA提取。采用与步骤9.2和9.3中构建载体和插入片段时所用的相同酶进行酶切分析。
7. 使用100 ng载体DNA进行测序，操作同8.8和8.9步骤。

10. 在 HEK 细胞中生产抗体

1. 在150 mm细胞培养皿中，使用添加10%胎牛血清、1% L-葡萄糖和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM+），将HEK细胞培养至75%融合度。步骤10.1至10.7需在生物安全柜中进行。
2. 转染前，更换培养基为不含胎牛血清的相同培养基。
3. 针对每一对重链和轻链的转染，配制转染混合液：2.5 ml 不含血清的DMEM、9 µg含重链的质粒、6 µg含轻链的质粒，以及100 µl 聚乙烯亚胺（PEI）溶液（来自1 µg/µl 的储存液）。室温孵育15分钟。
4. 将步骤10.3中制备的2.5 ml 转染混合液轻轻加入培养皿中的HEK细胞中。轻轻摇动培养皿使液体均匀分布。
5. 将细胞置于37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育24小时。
6. 更换为不含胎牛血清的培养基。
7. 4天后收集培养皿中的培养上清。
   注意：培养基中的抗体可用于体外 in vitro 和体内 in vivo反应性的表征。

表1. 使用的引物。

1st PCR 引物
	正向（5'-3'）	反向（3'-5'）
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
	5′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
	5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2nd PCR 引物
	正向（5'-3'）	反向（3'-5'）
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG
	5′ EcoRI VH1 至 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG
	5′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRIVH 3′ 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 1 至 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG	3′ AvrII Jλ 1至3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 4至5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT
	5′ EcoR1 Vλ 7至8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	含多蔗糖和泛影酸钠的溶液
FACSAria II 细胞分选仪	BD 生物科学
96孔U型底微孔板	Costar	3799
高级RPMI 1640培养基	Gibco，Life Technologies	12633-020
含B95-8细胞系上清液的30%（v/v）EBV病毒液	ATCC	CRL-1612	3.4 × 10⁸ 拷贝/毫升
CpG2006	Invivogen	ODN 7909
Wi38细胞	Sigma-Aldrich	90020107
白细胞介素-2	罗氏	10799068001
ELISA 板	Greiner Bio-One，Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人 IgG，Fcγ 片段特异性（未标记）	杰克逊免疫研究实验室	109-006-008
4% 脱脂奶粉（印迹级封闭剂）	伯乐（Bio-Rad）	170-6404
人IgG	Sigma	I 2511	人IgG纯化免疫球蛋白，5.6 mg/ml
山羊F(ab)2 抗人 IgG Fcγ（与过氧化物酶（PO）偶联）	杰克逊免疫研究实验室	109-036-008
ELISA 读板仪（Perkin Elmer 2030）	Perkin Elmer	2030-0050
辣根过氧化物酶标记的AffiniPure兔抗人IgM，Fc5µ	杰克逊免疫研究实验室	309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA合成系统	Invitrogen	18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR 系统 2700	应用生物系统公司
高纯度RNA提取试剂盒	罗氏	11828665001
逆转录系统试剂盒	Promega	A3500
重组 Taq DNA 聚合酶	TAKARA	R001A
引物（2 μl）	Sigma
超纯琼脂糖	Invitrogen	16500-500
100 bp DNA标准分子量标记	Invitrogen	15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)	伯乐（Bio-Rad）	170-8100
QIAquick PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	28106
BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒	应用生物系统公司	4337455
0.1 ml 反应板（MicroAMP 光学 96 孔板）	应用生物系统公司	4346906
遗传分析仪 ABI300	应用生物系统公司	4346906
DH5α 感受态细胞（E. coli）	Invitrogen	18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1（4493 bp）	Invivogen	pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4（4484 bp）	Invivogen	pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk（3875 bp）	Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2（3883 bp）	Invivogen	pfuse2ss-hcll2
SOC培养基	Invitrogen	15544-034
添加了Zeocin的LB琼脂培养基（Fast-Media Zeo Agar）	Invivogen	fas-zn-s
含Zeocin的Terrific Broth（TB）液体培养基（Fast-Media Zeo TB）	Invivogen	fas-zn-l
DNA 小量提取试剂盒	Omega Bio Technology	D6942-02
Nanodrop（ND1000 分光光度计）	Nanodrop
添加了杀稻瘟菌素的LB琼脂培养基（Fast-Media Blast Agar）	Invivogen	fas-bl-s
含杀稻瘟菌素（Blasticidin）的TB液体培养基（Fast-Media Blast TB）	Invivogen	fas-bl-l
EcoRI	新英格兰生物实验室	R0101S	20,000 U/ml，溶于10x NEBuffer EcoRI中
NheI	New England Biolabs	R0131S	10,000 U/ml，溶于10x NEBuffer 2.1中
2-Log DNA 标准品	New England Biolabs	N3200S	0.1-10.0 kb，1,000 μg/ml
XmaI	New England Biolabs	R0180S	10,000 U/ml，置于10x CutSmart缓冲液中
BsiWI	New England Biolabs	R0553S	10,000 U/ml，置于10x NEBuffer 3.1中
AvrII	New England Biolabs	R0174S	5,000 U/ml，置于10x CutSmart缓冲液中
FastAP 热敏碱性磷酸酶	赛默飞世尔科技	EF0651	1 U/µL，置于10x FastAP缓冲液中
DH5α 感受态细胞	Invitrogen	18263-012
PE小鼠抗人IgG	BD Pharmingen	555787
抗CD22，PerCP-Cy5.5，克隆号：HIB22	Fisher Scientific	BDB563942
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	QIAGEN	27106
BigDye Terminator v3.1	Applied Biosystems	4337455