来源：Nogales-Gadea, G. 等，从永生化分选B细胞生成重组人源IgG单克隆抗体 J. Vis. Exp. (2015)
本视频展示了一种通过将携带重链和轻链基因的质粒载体导入哺乳动物细胞来产生抗体的方法。这些载体与聚乙烯亚胺相互作用，通过形成多聚复合物进入细胞；随后，它们被翻译成单个蛋白质，并组装成完整的抗体，最终分泌到细胞外培养基中。
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方法文章
从哺乳动物细胞培养中制备重组单克隆抗体
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。
1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
- 在采血后尽快将25 ml 受试者的肝素抗凝血以900 × g离心15分钟。若血液量较少，应相应减少试剂用量。后续所有步骤均需在生物安全柜中进行。
- 将血清转移至洁净离心管中。该血清可用于后续步骤中PBMC的冻存，或针对自身免疫性疾病患者用于检测自身抗体。
- 用10 ml RPMI 1640培养基稀释血液，并通过吹打重悬细胞。
- 向一个新的50 ml 离心管中加入15 ml 含多蔗糖和泛影酸钠（密度为1.077 g/ml）的溶液。
- 将步骤1.3中的血液小心地叠加至步骤1.4的溶液上方：将两支离心管管口靠近，使液体缓慢接触，然后缓慢倾注PBMC悬液至50 ml 离心管液面上方。此步骤对实现PBMC的良好分离至关重要。
- 将步骤1.5所得离心管于室温（RT）下以400 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车。
- 离心结束后，用移液器小心吸取管中段出现的白色环状层，该层含有PBMCs。
- 用25 ml RPMI 1640培养基洗涤细胞。
- 于室温下以300 × g离心10分钟。
- 弃去上清液，用10 ml&#....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | 含多蔗糖和泛影酸钠的溶液 |
| FACSAria II 细胞分选仪 | BD 生物科学 | ||
| 96孔U型底微孔板 | Costar | 3799 | |
| 高级RPMI 1640培养基 | Gibco，Life Technologies | 12633-020 | |
| 含B95-8细胞系上清液的30%（v/v）EBV病毒液 | ATCC | CRL-1612 | 3.4 × 10⁸ 拷贝/毫升 |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38细胞 | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| 白细胞介素-2 | 罗氏 | 10799068001 | |
| ELISA 板 | Greiner Bio-One，Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人 IgG，Fcγ 片段特异性（未标记） | 杰克逊免疫研究实验室 | 109-006-008 | |
| 4% 脱脂奶粉（印迹级封闭剂） | 伯乐（Bio-Rad） | 170-6404 | |
| 人IgG | Sigma | I 2511 | 人IgG纯化免疫球蛋白，5.6 mg/ml |
| 山羊F(ab)2 抗人 IgG Fcγ（与过氧化物酶（PO）偶联） | 杰克逊免疫研究实验室 | 109-036-008 | |
| ELISA 读板仪（Perkin Elmer 2030） | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| 辣根过氧化物酶标记的AffiniPure兔抗人IgM，Fc5µ | 杰克逊免疫研究实验室 | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA合成系统 | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR 系统 2700 | 应用生物系统公司 | ||
| 高纯度RNA提取试剂盒 | 罗氏 | 11828665001 | |
| 逆转录系统试剂盒 | Promega | A3500 | |
| 重组 Taq DNA 聚合酶 | TAKARA | R001A | |
| 引物（2 μl） | Sigma | ||
| 超纯琼脂糖 | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp DNA标准分子量标记 | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | 伯乐（Bio-Rad） | 170-8100 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒 | 应用生物系统公司 | 4337455 | |
| 0.1 ml 反应板（MicroAMP 光学 96 孔板） | 应用生物系统公司 | 4346906 | |
| 遗传分析仪 ABI300 | 应用生物系统公司 | 4346906 | |
| DH5α 感受态细胞（E. coli） | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1（4493 bp） | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4（4484 bp） | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk（3875 bp） | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2（3883 bp） | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC培养基 | Invitrogen | 15544-034 | |
| 添加了Zeocin的LB琼脂培养基（Fast-Media Zeo Agar） | Invivogen | fas-zn-s | |
| 含Zeocin的Terrific Broth（TB）液体培养基（Fast-Media Zeo TB） | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA 小量提取试剂盒 | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop（ND1000 分光光度计） | Nanodrop | ||
| 添加了杀稻瘟菌素的LB琼脂培养基（Fast-Media Blast Agar） | Invivogen | fas-bl-s | |
| 含杀稻瘟菌素（Blasticidin）的TB液体培养基（Fast-Media Blast TB） | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | 新英格兰生物实验室 | R0101S | 20,000 U/ml，溶于10x NEBuffer EcoRI中 |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml，溶于10x NEBuffer 2.1中 |
| 2-Log DNA 标准品 | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb，1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml，置于10x CutSmart缓冲液中 |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml，置于10x NEBuffer 3.1中 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml，置于10x CutSmart缓冲液中 |
| FastAP 热敏碱性磷酸酶 | 赛默飞世尔科技 | EF0651 | 1 U/µL，置于10x FastAP缓冲液中 |
| DH5α 感受态细胞 | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE小鼠抗人IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| 抗CD22，PerCP-Cy5.5，克隆号：HIB22 | Fisher Scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
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