一种用于制备抗金属肽酶单克隆抗体的杂交瘤技术

摘要

来源：Xia, P.，等。生产靶向猪肠黏膜上皮中氨肽酶 N 的单克隆抗体。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了一种利用传统杂交瘤技术制备针对猪氨肽酶N（APN）的单克隆抗体的实验方法。APN是一种膜结合型金属肽酶。用APN免疫小鼠后，收集其脾细胞并与永生化骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。随后利用HAT（次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷）培养基筛选并扩增杂交瘤细胞，以产生针对不同APN表位的特异性单克隆抗体。

方案

所有动物模型实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 动物免疫

1. 将6至8周龄的雌性BALB/c小鼠皮下（s.c）注射50 µg APN蛋白或磷酸盐缓冲液（PBS，阴性对照），每2周注射一次，每次均与佐剂混合。初次免疫使用含热灭活分枝杆菌的完全弗氏佐剂，加强免疫使用不完全弗氏佐剂。分别将APN蛋白（或PBS）与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂等体积混合。
2. 采用间接酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测这些小鼠血清中抗APN的抗体滴度，使用包被了5 µg/mL APN蛋白（溶于0.05 M PBS，pH 9.6）的微量滴定板。 

2. 杂交瘤技术制备抗氨肽酶N（APN）的单克隆抗体

1. 对选定小鼠腹腔注射（i.p.）100 µg APN 蛋白，进行最终抗原加强。
2. 三天后，使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，v/v，腹腔注射）处死小鼠，并行颈椎脱位。
3. 取出脾脏，用 DMEM 洗涤两次以去除血液和脂肪细胞。使用 200 目铜网过滤脾细胞悬液以去除组织碎片，然后通过离心（1500 × g，10 分钟）收集脾细胞，以去除脾脏膜。
4. 将小鼠骨髓瘤 SP2/0 细胞接种于含 5 mL 添加 6% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的 25 cm² 培养瓶中，在 37 °C、6% CO₂ 条件下培养以维持细胞活力。复苏后培养 5–6 天，细胞达到 80%–90% 汇合度，处于对数生长期。显微镜下观察，细胞呈圆形、明亮且清晰。
5. 融合前一天，根据已发表的方法从小鼠腹腔收集巨噬细胞。
6. 将腹腔巨噬细胞以 0.1–0.2 × 10⁵/mL 的密度接种于 96 孔板中，每孔加入 100 µL HAT 培养基（含 10% FBS 和 1× HAT 补充剂的 DMEM），在 37 °C、6% CO₂ 湿润环境中孵育过夜。
7. 进行细胞融合时，用移液器轻轻吹打 8–10 瓶 SP2/0 细胞，重悬于 10 mL 无血清 DMEM 培养基中。用新鲜 DMEM 洗涤细胞，离心（1500 × g，10 分钟）两次，然后重悬于 10 mL DMEM 中。
8. 将定量的脾细胞与 SP2/0 细胞按 10:1 的比例混合，转移至 50 mL 离心管中。离心（1500 × g，10 分钟）后弃去上清液。收集管底的细胞沉淀，用手轻拍管底使沉淀松散，准备进行融合。
9. 将预热至 37 °C 的聚乙二醇 1500（PEG 1500）1 mL 使用滴管在 45 秒内逐滴加入松散的细胞沉淀中，同时轻轻旋转管底。
10. 缓慢加入 1 mL 预热至 37 °C 的 DMEM，用时 90 秒，随后再加入 30 mL 新鲜 DMEM。将融合管置于 37 °C 水浴中 30 分钟。
11. 水浴孵育后，收集细胞并重悬于 HAT 培养基中，然后接种至已铺有腹腔巨噬细胞的 96 孔板中进行培养。
12. 五天后，向每孔加入 100 µL 新鲜 HAT 培养基，继续孵育 5 天，之后将培养基更换为 HT 培养基（含 10% FBS 和 1× HT 补充剂的 DMEM）。
13. 使用包被了 5 µg/mL APN 蛋白（溶于 0.05 M PBS，pH 9.6）的酶标板，通过 ELISA 检测杂交瘤上清液中的单克隆抗体。
    1. 当 96 孔板中培养基变黄（由于细胞生长和代谢产物释放，培养基 pH 下降至 6.8，酚红由品红色变为黄色）或观察到细胞团簇时，从选定孔中取 100 µL 上清液加入包被的 ELISA 板孔中。使用酶标仪测定 OD₄₅₀ 值。
    2. 分别以抗 APN 多克隆抗体和未感染小鼠血清作为阳性和阴性对照，以 PBS 作为空白对照。本研究中，样本与阴性对照的 OD₄₅₀ 比值（P/N）≥ 2.1 被认定为阳性筛选标准。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5881	动物免疫
DMEM	Gibco	11965092	细胞培养
DMEM-F12	Gibco	12634010	细胞培养
增强型细胞计数试剂盒-8	Beyotime Biotechnology	C0042	细胞活力与活性检测
胎牛血清	Gibco	10091	细胞培养
Geneticin™ 选择性抗生素	Gibco	11811098	选择性抗生素
HAT 补充剂 (50X)	Gibco	21060017	细胞筛选
HT 补充剂 (100X)	Gibco	11067030	细胞筛选
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506	动物免疫
酶标仪	BioTek	BOX 998	ELISA 分析
聚乙二醇 1500	Roche Diagnostics	10783641001	细胞融合
96 孔微孔板	Corning	3599	细胞培养