一种用于制备抗金属肽酶单克隆抗体的杂交瘤技术

摘要

来源：Xia, P.，等。生产靶向猪肠黏膜上皮中氨肽酶 N 的单克隆抗体。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频演示了一种利用传统杂交瘤技术制备针对猪氨肽酶N（APN）的单克隆抗体的实验方法。APN是一种膜结合型金属肽酶。用APN免疫小鼠后，收集其脾细胞并与永生化骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。随后利用HAT（次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷）培养基筛选并扩增杂交瘤细胞，以产生针对不同APN表位的特异性单克隆抗体。

方案

所有动物模型实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 动物免疫

1. 将6至8周龄的雌性BALB/c小鼠皮下（s.c）注射50 µg APN蛋白或磷酸盐缓冲液（PBS，阴性对照），每2周注射一次，每次均与佐剂混合。初次免疫使用含热灭活分枝杆菌的完全弗氏佐剂，加强免疫使用不完全弗氏佐剂。分别将APN蛋白（或PBS）与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂等体积混合。
2. 采用间接酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测这些小鼠血清中抗APN的抗体滴度，使用包被了5 µg/mL APN蛋白（溶于0.05 M PBS，pH 9.6）的微量滴定板。 

2. 杂交瘤技术制备抗氨肽酶N（APN）的单克隆抗体

1. 对选定小鼠腹腔注射（i.p.）100 µg APN 蛋白，进行最终抗原加强。
2. 三天后，使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，v/v，腹腔注射）处死小鼠，并行颈椎脱位。
3. 取出脾脏，用 DMEM 洗涤两次以去除血液和脂肪细胞。使用 200 目铜网过滤脾细胞悬液以去除组织碎片，然后通过离心（1500 × g，10 分钟）收集脾细胞，以去除脾脏膜。
4. 将小鼠骨髓瘤 SP2/0 细胞接种于含 5 mL 添加 6%....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5881	动物免疫
DMEM	Gibco	11965092	细胞培养
DMEM-F12	Gibco	12634010	细胞培养
增强型细胞计数试剂盒-8	Beyotime Biotechnology	C0042	细胞活力与活性检测
胎牛血清	Gibco	10091	细胞培养
Geneticin™ 选择性抗生素	Gibco	11811098	选择性抗生素
HAT 补充剂 (50X)	Gibco	21060017	细胞筛选
HT 补充剂 (100X)	Gibco	11067030	细胞筛选
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506	动物免疫
酶标仪	BioTek	BOX 998	ELISA 分析
聚乙二醇 1500	Roche Diagnostics	10783641001	细胞融合
96 孔微孔板	Corning	3599	细胞培养