一种针对金属肽酶产生重组抗体的方法

摘要

来源：Xia, P. 等，生产靶向猪肠黏膜上皮氨肽酶 N 的单克隆抗体 J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了一种针对金属肽酶的重组抗体的制备方法。携带编码抗体、绿色荧光蛋白及抗生素抗性基因的重组质粒，通过脂质体转染试剂转染至上皮细胞中。对转染后的细胞进行筛选和培养，以产生重组抗体。

方案

1. 猪氨基肽酶N（APN）蛋白抗原的制备

注意：pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) 菌株以及稳定表达 APN 的细胞 pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 已在先前的研究中构建完成。

1. 从冻存的甘油菌种中复苏细菌，并在含有 50 µg/mL 卡那霉素（Km⁺）的 Luria-Bertani（LB）平板上划线，以获得单菌落。
2. 从新鲜划线的平板上挑取单菌落，接种于 4 mL LB 培养基（10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 氯化钠（NaCl）和 5 g/L 酵母提取物，pH 7.2）中，加入 Km⁺ （50 µg/mL），于 37 °C 振荡培养过夜（12–16 小时，178 rpm）。
3. 将上述培养物按 1:100 比例稀释至新鲜的 Km⁺ LB 液体培养基中，于 37 °C 摇床培养 2–3 小时，直至 OD₆₀₀ 达到 0.4–0.6。
4. 向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为 0.4 mM，继续于 16 °C 培养 10 小时。
5. 随后，通过离心收集经 IPTG 诱导的细菌（10,000 × g，4 °C，15 分钟）。
6. 用含 1 mg/mL 溶菌酶的 5 mL LEW（裂解/平衡/洗涤）缓冲液（50 mM 无水磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）和 300 mM NaCl，pH 8.0）重悬菌体沉淀，在冰上搅拌 30 分钟，并使用超声波破碎仪彻底超声处理（脉冲 15 秒，间隔 20 秒，共 15 分钟）。
7. 将粗制细胞裂解液于 4 °C、10,000 × g 离心 30 分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至预平衡的层析柱中，孵育 1–2 分钟后自然重力流穿，重复此步骤三次。
8. 用 20 mL LEW 缓冲液洗涤层析柱，并通过重力流排出。使用 9 mL 洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl 和 250 mM 咪唑，pH 8.0）洗脱带有组氨酸标签的 APN 蛋白，并收集至透析袋中。
9. 将蛋白溶液在 4 °C 下，于碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS），135 mM NaCl、4.7 mM 氯化钾、2 mM NaH₂PO₄ 和 10 mM 十二水合磷酸氢二钠，pH 7.2）中透析过夜。
10. 采用 12.0% SDS-PAGE 凝胶电泳及蛋白质印迹（western blotting）分析 APN 蛋白的纯度。
    1. 每孔上样 5 µg 蛋白，于 110 V 电压下电泳 1.5 小时。随后在 15 V 电压下将蛋白转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续 50 分钟。使用二喹啉酸（BCA）法测定纯化蛋白的浓度。

2. 动物免疫

1. 将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠皮下（s.c）注射50 µg APN蛋白或PBS（阴性对照），每2周注射一次，每次均与佐剂混合。初次免疫使用含热灭活分枝杆菌的完全弗氏佐剂，加强免疫使用不完全弗氏佐剂。分别将APN蛋白（或PBS）与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂等体积混合。
2. 采用间接酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测这些小鼠血清中抗APN的抗体滴度，使用包被了5 µg/mL APN蛋白（溶于0.05 M PBS，pH 9.6）的微量滴定板进行检测。

3. 杂交瘤技术制备抗氨肽酶N（APN）的单克隆抗体

1. 对选定小鼠腹腔内（i.p.）注射 100 µg APN 蛋白，进行最终抗原加强免疫。
2. 三天后，使用戊巴比妥钠（50 mg/kg，v/v，腹腔注射）处死小鼠，并辅以颈椎脱位法。
3. 取出脾脏，用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）清洗两次，以去除血液和脂肪细胞。使用 200 目铜网过滤脾细胞悬液，以去除组织碎片，并通过离心（1500 × g，10 分钟）收集脾细胞，以去除脾脏膜。
4. 将小鼠骨髓瘤 SP2/0 细胞接种于含 5 mL DMEM 的 25 cm² 培养瓶中，DMEM 中添加 6% 胎牛血清（FBS），在 37 °C、6% 二氧化碳（CO₂） 的湿润环境中培养以维持细胞活力。复苏后培养 5-6 天，细胞融合度达到 80%-90%，处于对数生长期。显微镜下观察，细胞呈圆形、明亮且清晰。
5. 在细胞融合前一天，根据已发表的方法从小鼠腹腔收集巨噬细胞。
6. 将腹腔巨噬细胞以 0.1-0.2 × 10⁵/mL 的密度接种于 96 孔板中，每孔加入 100 µL 次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）培养基（含 10% FBS 和 1× HAT 补充剂的 DMEM），在 37 °C、6% CO₂ 的湿润环境中孵育过夜。
7. 进行细胞融合时，用移液器轻轻吸取 8-10 瓶 SP2/0 细胞，悬浮于 10 mL 无血清 DMEM 培养基中。用新鲜 DMEM 洗涤细胞，离心（1500 × g，10 分钟）两次，然后重悬于 10 mL DMEM 中。
8. 将定量的脾细胞与 SP2/0 细胞按 10:1 的比例混合，转移至 50 mL 离心管中。离心（1500 × g，10 分钟）后弃去上清液。收集管底的细胞沉淀，用手轻拍管底使沉淀松散，准备进行融合。
9. 将预热至 37 °C 的聚乙二醇 1500（PEG 1500）1 mL 用滴管在 45 秒内逐滴加入松散的细胞沉淀中，同时轻轻旋转管底。
10. 在 90 秒内缓慢加入 1 mL 预热至 37 °C 的 DMEM，随后再加入 30 mL 新鲜 DMEM。将融合管置于 37 °C 水浴中 30 分钟。
11. 水浴孵育后，收集细胞并重悬于 HAT 培养基中，然后接种至预先接种了腹腔巨噬细胞的 96 孔板中进行培养。
12. 五天后，向每孔加入 100 µL 新鲜 HAT 培养基，继续孵育 5 天，之后将培养基更换为 HT 培养基（含 10% FBS 和 1× HT 补充剂的 DMEM）。
13. 使用包被了 5 µg/mL APN 蛋白（溶于 0.05 M PBS，pH 9.6）的酶标板，通过 ELISA 检测杂交瘤上清液中的单克隆抗体。
    1. 当 96 孔板中培养基变黄（由于细胞生长和代谢产物释放，培养基 pH 下降至 6.8，酚红由品红色变为黄色）或观察到细胞团簇时，从选定孔中取 100 µL 上清液加入包被的 ELISA 板孔中。使用酶标仪测定 450 nm 处的光密度（OD450）值。
    2. 分别以抗 APN 多克隆抗体和未感染小鼠血清作为阳性和阴性对照，以 PBS 作为空白对照。本研究中，样本与阴性对照的 OD450 比值（P/N）≥ 2.1 被认定为阳性筛选标准。
14. 经过连续三轮阳性筛选后，选择对 APN 蛋白血清学反应增强的杂交瘤细胞进行有限稀释法克隆。
    1. 制备腹腔巨噬细胞，并按前述方法接种于 96 孔板中。
    2. 将杂交瘤细胞悬浮于 HT 培养基中，按平均每孔 0.5-2 个细胞的密度接种，在 37 °C、6% CO₂ 的培养箱中培养。重复此步骤三至四次，直至 ELISA 免疫检测显示阳性率达到 100%。
15. 在反复冻融压力下，筛选能够稳定分泌抗 APN 抗体并正常增殖的阳性杂交瘤细胞。
    1. 向每只小鼠（8-10 周龄）腹腔注射 0.3 mL 降植烷。给予降植烷 10 天后，向每只小鼠注射 2-5 × 10⁵ 杂交瘤细胞于 0.5 mL PBS（pH 7.2）中。
    2. 注射后 8 至 10 天，小心收集这些小鼠腹腔中的腹腔液。
    3. 通过 5,000 × g 离心 15 分钟收集上清液，并使用 33% 饱和硫酸铵 [(NH₄)₂SO₄] 沉淀和蛋白 A 琼脂糖纯化上清液中的抗体。

4. 抗APN蛋白单克隆抗体（mAbs）的表征

1. 使用 SBA Clonotyping System-HRP 确定所收集单克隆抗体（mAb）的免疫球蛋白亚型。通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹法（western blotting）评估单克隆抗体的纯度和特异性。
2. 采用 ELISA 分析单克隆抗体对 APN 蛋白的表位特异性。 加和性值（AV）是 OD_{mAbs (a+b)} 与（OD_mAbs-a + OD_mAbs-b）的比值，用于判断单克隆抗体是否识别相同的抗原位点；其中 OD_mAbs-a 和 OD_mAbs-b 分别代表两种不同的单克隆抗体单独作用于 APN 时的 OD450 值，OD_{mAbs (a+b)} 代表两种单克隆抗体以 1:1 混合后作用于 APN 时的 OD450 值。
   1. 每个样本至少设置四个重复，并至少重复整个实验三次。

5. 抗APN重组抗体的表达

1. 从上述杂交瘤细胞及APN免疫小鼠的脾脏中提取总RNA（例如使用TRIzol法），并按照制造商说明书，利用cDNA合成试剂盒合成互补DNA（cDNA）。
2. 使用巢式聚合酶链式反应（PCR）扩增单克隆抗体的可变区，并通过测序确定重链（VH）和轻链（VL）序列。使用IMGT小鼠基因组分析工具（http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php）分析编码VH和VL的基因。
3. 将VH和VL基因分别与信号肽序列连接，并利用无缝克隆技术将其依次亚克隆至pET28a(+)和pIRES2-ZsGreen1载体中，以实现无痕DNA片段插入。所用特异性引物列于 表1。
4. 将转化了pET28a(+)-rAbs-APN-BL21的细菌在含0.4 mM IPTG的培养基中，于37 °C、摇床条件下培养10小时。随后诱导表达，通过常规蛋白纯化方法纯化并检测rAbs蛋白的表达情况。
5. 将100 µL含0.5 × 10⁵ 个CHO细胞的悬液接种至96孔板的每孔中，在37 °C、6% CO₂ 条件下培养18–24小时。当细胞融合度达到80–90%时，用Opti-MEM将pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN质粒稀释至终浓度0.1 µg/µL，室温孵育5分钟，用于后续转染。
6. 将50 µL稀释后的pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN质粒与1 µL Lipofectamine 2000及49 µL Opti-MEM轻柔混匀，室温孵育20分钟。将100 µL混合液加入含CHO细胞的96孔板各孔中，在37 °C、6% CO₂ 条件下继续孵育4–6小时。
7. 转染后4–6小时，更换为含10% FBS的DMEM-F12培养基，继续培养48小时。随后向每孔加入400 µg/mL G418，以筛选稳定转染的细胞。
8. 在使用含10% FBS和400 µg/mL G418的DMEM-F12培养基筛选10天后，通过流式细胞分选技术对细胞（3.0 × 10⁷ 个细胞/mL）进行分选，约10–15%的细胞呈阳性。
9. 将收获的阳性细胞进行连续稀释，以平均每孔0.5–2个细胞的密度接种至96孔板中，在37 °C、6% CO₂ 培养箱中培养。使用含G418（200 µg/mL）的筛选培养基维持稳定转染的pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO细胞。
10. 在为期3周的对数生长期期间，逐步将上述细胞培养基中的FBS浓度从10%递减至0%。随后将贴壁生长的CHO细胞适应至无血清培养基中的悬浮培养状态。
11. 将接种的pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO细胞在对数生长期以0.8–1.0 × 10⁵ 个细胞/mL的密度，于无血清培养基中、摇瓶内以80–110 rpm的振荡速度、37 °C、6% CO₂条件下进行培养。
12. 每隔12小时收集细胞悬液，按照制造商说明书使用细胞计数试剂盒（如CCK-8）检测细胞活力和活性的变化。
13. 当细胞活力下降至80%，细胞密度达到1.0–2.0 × 10⁶ 个细胞/mL时，抗体表达达到峰值。通过离心收集细胞上清液，使用0.22 µm聚四氟乙烯膜过滤，并采用蛋白A琼脂糖进行纯化。
14. 使用间接免疫荧光法（IFA）确认APN特异性抗体的产生。
15. 采用ELISA法测定抗体滴度和结合亲和力，方法如前所述。 使用软件通过四参数逻辑方程计算抗体的平衡解离常数（K_D 值）。

表1. 本研究中使用的所有特异性引物。

引物	序列 (5'-3')
VH-VL-F	CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG
VH-VL-R	CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT
pET28a (+)-F	TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA
pET28a (+)-R	CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC
pIRES2-ZsGreen1-F	CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA
pIRES2-ZsGreen1-R	GGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5881	动物免疫
DAPI	Beyotime  生物技术	C1002	细胞核复染
DMEM	Gibco	11965092	细胞培养
DMEM-F12	Gibco	12634010	细胞培养
Dylight 549 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗	Abbkine	A23310	间接免疫荧光分析
增强型细胞计数试剂盒-8	Beyotime  生物技术	C0042	测量 的 细胞 存活率与活力
胎牛血清	Gibco	10091	细胞培养
遗传霉素™ 选择性抗生素	Gibco	11811098	选择性抗生素
HAT补充剂（50倍浓缩）	Gibco	21060017	细胞筛选
HT补充剂（100倍浓缩）	Gibco	11067030	细胞筛选
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506	动物免疫
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷	Sigma-Aldrich	I5502	蛋白质表达
卡那霉素	Beyotime  生物技术	ST102	杀菌性抗生素
Leica TCS SP8 STED 共聚焦显微镜	徕卡显微系统	SP8 STED	荧光成像
Lipofectamine® 2000 试剂	赛默飞世尔科技	11668019	转染
LSRFortessa™ 荧光激活细胞分选	BD	FACS LSRFortessa	流式细胞术
酶标仪	BioTek	盒 998	ELISA 分析
显微分光光度计	Thermo Fisher	Nano Drop one	核酸浓度检测
NaCl	国药集团化学试剂	10019308	培养液
(NH4)2SO4	国药集团化学试剂	10002917	培养液
Opti-MEM	Gibco	31985088	细胞培养
聚乙二醇 1500	罗氏诊断	10783641001	细胞融合
PrimeScript™ 第一链 cDNA 合成试剂盒	Takara Bio	RR047	qPCR
蛋白A琼脂糖	Beyotime  生物技术	P2006	抗体蛋白纯化
Protino® Ni+-TED 2000 预装柱	MACHEREY-NAGEL	745120.5	蛋白质纯化
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	5月-00	小鼠单克隆抗体的同种型鉴定
无缝克隆试剂盒	Beyotime  生物技术	D7010S	质粒的构建
摇瓶	Beyotime  生物技术	E3285	细胞培养
碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液	Beyotime  生物技术	C0221A	细胞培养
Trans-Blot SD 半干式转印槽	伯乐（Bio-rad）	170-3940	蛋白质印迹
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042	培养液
超声波均质器	宁波新芝生物科技股份有限公司	JY92-IIN	样品均质化
酵母提取物	Oxoid	LP0021	培养液
96孔微孔板	康宁	3599	细胞培养