一种针对金属肽酶产生重组抗体的方法

摘要

来源：Xia, P. 等，生产靶向猪肠黏膜上皮氨肽酶 N 的单克隆抗体 J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了一种针对金属肽酶的重组抗体的制备方法。携带编码抗体、绿色荧光蛋白及抗生素抗性基因的重组质粒，通过脂质体转染试剂转染至上皮细胞中。对转染后的细胞进行筛选和培养，以产生重组抗体。

方案

1. 猪氨基肽酶N（APN）蛋白抗原的制备

注意：pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) 菌株以及稳定表达 APN 的细胞 pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 已在先前的研究中构建完成。

1. 从冻存的甘油菌种中复苏细菌，并在含有 50 µg/mL 卡那霉素（Km⁺）的 Luria-Bertani（LB）平板上划线，以获得单菌落。
2. 从新鲜划线的平板上挑取单菌落，接种于 4 mL LB 培养基（10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 氯化钠（NaCl）和 5 g/L 酵母提取物，pH 7.2）中，加入 Km⁺ （50 µg/mL），于 37 °C 振荡培养过夜（12–16 小时，178 rpm）。
3. 将上述培养物按 1:100 比例稀释至新鲜的 Km⁺ LB 液体培养基中，于 37 °C 摇床培养 2–3 小时，直至 OD₆₀₀ 达到 0.4–0.6。
4. 向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为 0.4 mM，继续于 16 °C 培养 10 小时。
5. 随后，通过离心收集经 IPTG 诱导的细菌（10,000 × g，4 °C，15 分钟）。
6. ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5881	动物免疫
DAPI	Beyotime  生物技术	C1002	细胞核复染
DMEM	Gibco	11965092	细胞培养
DMEM-F12	Gibco	12634010	细胞培养
Dylight 549 标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗	Abbkine	A23310	间接免疫荧光分析
增强型细胞计数试剂盒-8	Beyotime  生物技术	C0042	测量 的 细胞 存活率与活力
胎牛血清	Gibco	10091	细胞培养
遗传霉素™ 选择性抗生素	Gibco	11811098	选择性抗生素
HAT补充剂（50倍浓缩）	Gibco	21060017	细胞筛选
HT补充剂（100倍浓缩）	Gibco	11067030	细胞筛选
不完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich	F5506	动物免疫
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷	Sigma-Aldrich	I5502	蛋白质表达
卡那霉素	Beyotime  生物技术	ST102	杀菌性抗生素
Leica TCS SP8 STED 共聚焦显微镜	徕卡显微系统	SP8 STED	荧光成像
Lipofectamine® 2000 试剂	赛默飞世尔科技	11668019	转染
LSRFortessa™ 荧光激活细胞分选	BD	FACS LSRFortessa	流式细胞术
酶标仪	BioTek	盒 998	ELISA 分析
显微分光光度计	Thermo Fisher	Nano Drop one	核酸浓度检测
NaCl	国药集团化学试剂	10019308	培养液
(NH4)2SO4	国药集团化学试剂	10002917	培养液
Opti-MEM	Gibco	31985088	细胞培养
聚乙二醇 1500	罗氏诊断	10783641001	细胞融合
PrimeScript™ 第一链 cDNA 合成试剂盒	Takara Bio	RR047	qPCR
蛋白A琼脂糖	Beyotime  生物技术	P2006	抗体蛋白纯化
Protino® Ni+-TED 2000 预装柱	MACHEREY-NAGEL	745120.5	蛋白质纯化
SBA Clonotyping System-HRP	Southern Biotech	5月-00	小鼠单克隆抗体的同种型鉴定
无缝克隆试剂盒	Beyotime  生物技术	D7010S	质粒的构建
摇瓶	Beyotime  生物技术	E3285	细胞培养
碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液	Beyotime  生物技术	C0221A	细胞培养
Trans-Blot SD 半干式转印槽	伯乐（Bio-rad）	170-3940	蛋白质印迹
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042	培养液
超声波均质器	宁波新芝生物科技股份有限公司	JY92-IIN	样品均质化
酵母提取物	Oxoid	LP0021	培养液
96孔微孔板	康宁	3599	细胞培养