一种用于研究抗体激活Fc受体的体外人工激活检测方法

摘要

来源：Petriello, A. 等. 在治疗性抗体存在下通过FcγRIIIa结合驱动的人自然杀伤细胞事件的评估. 视觉化实验杂志 (2020)

本视频展示了由治疗性抗体在人自然杀伤细胞中引发的FcγRIIIa介导的事件。该人工刺激平台有助于研究下游效应功能，包括细胞骨架重排、脱颗粒、趋化因子/细胞因子产生，以及由抗体FcγRIIIa和Fc区结合所介导的信号通路。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 外周血单个核细胞的分离及自然杀伤细胞的富集/纯化

注意：也可采用其他方法分离外周血单个核细胞（PBMCs）并进行富集/纯化。

1. 在受控条件下，采集200 mL血液至含有肝素的采血管中。
2. 向一个带有孔隙屏障的50 mL离心管中加入15 mL密度梯度介质，以1000 x g离心30秒。
3. 向该管中加入12.5 mL血液，随后加入12.5 mL PBS，轻轻颠倒混匀3次。在室温（RT）下以800 x g离心15分钟，不启用刹车。
4. 在细胞离心过程中，为每个带孔隙屏障的离心管预先准备一个含有40 mL PBS的50 mL离心管。
5. 离心结束后小心取出离心管并进行观察。检查在50 mL离心管的20 mL至25 mL刻度之间、孔隙屏障上方是否存在一层薄而明显的白色PBMC层。
6. 使用移液器小心吸除上层尽可能多的液体，避免扰动下方薄而白色的PBMC层。
7. 用一支洁净的10 mL血清移液管，轻柔地将PBMC层以及其下方的澄清淡黄色液体层一并吸出，直至到达管内滤膜处。
8. 将吸出的PBMC和液体排入步骤1.4中已准备好的含PBS的50 mL离心管中。在室温下以300 x g离心5分钟。
9. 吸除PBS洗涤液，并加入额外的40 mL PBS。在室温下以300 x g再次离心5分钟。
10. 洗涤完成后，对细胞进行计数，并以每1 × 10⁷个细胞加入40 µL含2% BSA的PBS重悬细胞。
11. 采用所选方法继续进行NK细胞的分离。可选方法包括手动或自动磁珠分选法，也可进行荧光激活细胞分选（FACS）。
12. 分离前取少量细胞样本，通过流式细胞术检测NK细胞纯度。设门策略如下：根据前向散射光与侧向散射光图谱圈选活细胞，然后在该活细胞群体中依据NK细胞标志物（如CD3、CD56）评估纯度。典型纯度可达>95%。
13. 完成分离后，在室温下以300 x g离心5分钟，使细胞沉淀，随后吸除上清液。
14. 将细胞沉淀重悬于RPMI 1640培养基中，终浓度为1 × 10⁷ cells/mL，培养基中包含营养成分、10%热灭活胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠、55 mM 2-巯基乙醇（2-ME）和10 mM HEPES（pH = 7.2）。

2. 通过 FcγRIIIa 的抗体介导激活 NK 细胞

1. 将制冷型微量离心机预设至 4 °C。
2. 将重悬的 NK 细胞按每份 1 × 10⁶ 个（100 µL）分装至 1.5 mL 离心管中，并置于冰上。
   注意：若样本数量较多，可将细胞分装至 96 孔 U 型底板中。
3. 每份样本准备 1 µL 浓度为 100 µg/mL 的利妥昔单抗（或目标抗体），加入细胞中，使抗体终浓度为 1 μg/mL。
   注意：此时或更早阶段可向细胞中添加其他分子，以评估联合效应。本实验中使用利妥昔单抗进行刺激；在先前研究中，小分子抑制剂已被加入刺激体系中。
4. 将样本置于冰上孵育 30 分钟。在孵育期间，按每份样本准备含 50 μL 浓度为 50 µg/mL 的抗人 κ 轻链抗体的培养基，并在加热块或水浴中预热至 37 °C。
5. 细胞冰上孵育结束后，加入 1 mL 冰冷培养基，于 4 °C 下以 135 x g 离心 5 分钟。再用 1 mL 冰冷培养基洗涤一次。
6. 最后一次洗涤后，吸除上清液，加入 50 µL 步骤 2.4 中配制的抗人 κ 轻链抗体混合液。
7. 立即在 37 °C 加热块或水浴中孵育样本，孵育时间由最终使用者确定。
8. 通过加入 1 mL 冰冷培养基终止刺激，并立即在制冷离心机中以 135 x g 于 4 °C 离心 5 分钟。再用 1 mL 冰冷培养基洗涤一次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛	Thermo Fisher Scientific	50-980-487
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	A12379
抗小鼠 HRP 抗体	Cell Signaling Technologies	7076
AutoMACS 仪器	Miltenyi		NK 细胞分离方法；可使用其他分离仪器
CD107a APC 抗体	Biolegend	328620
牛血清白蛋白 V 型，无脂肪酸	Millipore Sigma	10775835001
细胞因子 30-plex 人面板	Thermo Fisher Scientific	LHC6003M	趋化因子/细胞因子检测方法；可使用其他趋化因子/细胞因子分析方法
FBS（胎牛血清）	Hyclone	SH30071.01
山羊抗人 κ 轻链 抗体	Millipore Sigma	AP502
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液	Thermo Fisher Scientific	78440
pAKT (S473) 抗体	Cell Signaling Technologies
pERK1/2 抗体	Cell Signaling Technologies
pPRAS40 抗体	Cell Signaling Technologies	13175
β-actin HRP 抗体	Abcam	ab6721
NK 细胞分离试剂盒	Miltenyi	130-092-657	NK 细胞分离试剂盒；可使用其他分离试剂盒