一种从抗原特异性B细胞生成单克隆抗体的技术

摘要

来源：Devilder, M., 等 从血液中循环的稀有抗原特异性B细胞生成具有区分能力的人源单克隆抗体。J. Vis. Exp. (2018)。

该视频展示了一种从抗原特异性B细胞中制备单克隆抗体的技术。从分离的抗原特异性B细胞中克隆编码抗体重链和轻链的真核表达载体，通过多聚复合物将其导入哺乳动物细胞。进入细胞后，这些载体进行翻译，产生的重链和轻链多肽组装成抗体，并由细胞分泌出来。

方案

1. 单克隆抗体的制备

1. 转染前一天，在96孔板中每孔加入含10%胎牛血清（FBS）的200 µL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），接种15,000个人胚肾293A（HEK 293A）细胞。在37 °C、5% CO₂的CO₂培养箱中过夜培养。
2. 使用线性聚乙烯亚胺衍生物作为转染试剂，在含10% FBS的DMEM培养基中对293A细胞进行共转染。
   注意：转染实验需设三个重复。以下方案适用于平底96孔板的一个孔。
   1. 将0.5 µL DNA转染试剂稀释至10 µL 150 mM NaCl溶液中。将0.125 µg编码可变重链（vH）和0.125 µg编码可变轻链（vL）的表达载体分别稀释至10 µL 150 mM NaCl溶液中。每种稀释液涡旋振荡10秒。
   2. 将10 µL稀释后的DNA转染试剂加入10 µL DNA溶液中，涡旋振荡15秒，室温孵育15分钟。将20 µL混合液逐滴加入293A细胞中，并轻轻摇动培养板混匀。
3. 转染后16小时更换培养基，并在无血清培养基中继续培养5天。
   注意：使用无血清培养基以避免血清免疫球蛋白（Igs）污染所表达的抗体。
4. 以460 × g离心5分钟，去除细胞和碎片。
5. 用多通道移液器吸取上清液，并转移至V型底96孔板中。
6. 在96孔ELISA板中，每孔加入100 µL重悬的酶联免疫吸附试验（ELISA）/酶联免疫斑点（ELISPOT）包被缓冲液1×，加入相应抗原至终浓度为2 µg/mL，4 °C包被过夜。
7. 用含10% FBS的DMEM培养基在37 °C封闭2小时。
8. 加入50 µL来自步骤1.5的转染293A细胞上清液，在室温孵育2小时。
9. 加入100 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人免疫球蛋白G抗体（IgG Ab），终浓度为1 µg/mL，在室温孵育1小时。然后加入50 µL显色底物（3,3',5,5'-四甲基联苯胺，TMB），孵育20分钟。
10. 在分光光度计上测定450 nm处的吸光度。
    注意：通过ELISA检测到的特异性单克隆抗体可进一步大规模生产，并通过具有人IgG亲和力的蛋白A柱进行纯化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEK 293A 细胞系	Thermo Fisher Scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco 改良 Eagle 培养基	Gibco by Life Technologies	21969-035	(+) 4.5 g/L D-葡萄糖 0.11 g/L 丙酮酸钠 (-) L-谷氨酰胺
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X 浓缩液
胎牛血清 (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Jet PEI DNA 转染试剂	PolyPlus	101-40
平底 96 孔板	Falcon	353072
V 型底 96 孔板	Nunc/ThermoFisher	55142