对流增强递送抗体至小鼠脑部

摘要

来源：Beffinger, M.，等。通过对流增强递送将抗体递送至小鼠脑内。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种用于将抗体递送至小鼠脑部的对流增强递送（CED）技术。暴露麻醉小鼠的颅骨，并在目标区域钻出一个骨孔以用于抗体递送。将含有抗体的阶梯式导管插入目标部位，并通过输注泵产生压力梯度，以可控速率递送抗体。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 阶梯导管的制备

1. 制作用于导管台阶步骤的熔融石英管
   1. 将内径为0.1 mm、壁厚为0.0325 mm的熔融石英毛细管切割成30 mm长。
   2. 检查管材是否有裂纹，并使用微熔器对管端进行热抛光，以确保管口表面光滑。
2. 将内管固定于金属针头中
   1. 将27 G针头安装在10 μL注射器上，并将注射器置于立体定位机器人中。
   2. 使用机器人将注射器移至硬质表面，并用针尖轻触该表面。应记录或在软件中保存此位置，因其将作为设定导管台阶长度的参考平面。
   3. 抬升针头，以便将熔融石英毛细管插入针头内部。
   4. 将熔融石英毛细管插入针头，使毛细管有20 mm部分从针头端伸出。
   5. 使用移液器，从金属针头处开始，向上延伸至毛细管下端以上10 mm处，均匀涂抹2 μL高黏度氰基丙烯酸酯胶水，如图1所示。
   6. 使用立体定位机器人，将针头下移，直至金属针头尖端位于参考平面上方1 mm处。这样可使熔融石英毛细管在金属针头中固定，形成距针尖1 mm的台阶。清除金属针头末端多余的胶水，以避免台阶钝化。
   7. 等待15分钟使胶水固化，然后将带有导管的注射器从立体定位机器人上取下。在显微镜下检查导管尖端，确认台阶处所有多余胶水均已清除。
3. 使用琼脂糖块测试台阶导管
   1. 在常规凝胶托盘中配制0.6%磷酸盐缓冲液（PBS）琼脂糖溶液，待其聚合后，切成约20 mm × 20 mm的块状。使用前将琼脂糖块浸没于PBS中保存。
   2. 手动将10 μL过滤后的0.4%台盼蓝溶液注入台阶导管注射器中。
   3. 使用立体定位机器人以0.2 μL/min的速度注入1 μL液体，以评估固定过程中导管台阶的密封性。台盼蓝溶液应仅出现在导管尖端，随后用纸巾擦拭干净。
   4. 将琼脂糖块置于立体定位机器人中，并校准机器人，使导管尖端相对于琼脂糖块表面定位。
   5. 设定对流增强递送（CED）的注射参数。
      1. 对于5 µL的注射体积，采用以下步骤：先以0.2 µL/min注入1 µL，再以0.5 µL/min注入2 µL，最后以0.8 µL/min注入2 µL。根据具体实验计划，按比例调整各阶段持续时间，以调节最终注射体积。
      2. 向小鼠尾状壳核（纹状体）注射时，定位点应位于前囟前方1 mm、侧方1.5–2 mm，深度为3.5 mm。
      3. 注射完成后，保持导管原位2分钟，然后以1 mm/min速度回撤，以确保液体在脑组织中充分扩散，并在拔出导管时封闭注射通道。
         注意：所有参数可根据具体立体定位机器人的功能编程为单一操作脚本。
   6. 启动CED程序，向琼脂糖块中注入5 μL台盼蓝溶液。
   7. 观察台盼蓝在琼脂糖中的弥散形态及沿导管路径是否存在泄漏。台盼蓝应形成以导管尖端为中心的椭球形或圆形弥散区，直径至少为1 mm。金属针头尖端上方不应出现明显的反流现象。
   8. 更换新的琼脂糖块，以0.2 μL/min速度进行第二次1 μL注射，以评估导管是否被琼脂糖堵塞。注射开始后，台盼蓝应立即从导管尖端开始形成弥散云状。
   9. 检查注射器中剩余液体体积是否为3 μL。任何偏差可能提示导管安装处或注射器活塞存在液体泄漏。
   10. 若所有测试注射均成功，导管密封良好且无弯曲，且仅在导管尖端观察到台盼蓝溶液而无其他部位渗出，则用去离子H₂O（dH₂O）冲洗导管，直至无台盼蓝残留痕迹，随后依次用70%乙醇和100%乙醇各冲洗10次，再用70%乙醇和洁净去离子水冲洗。
   11. 将导管置于干燥条件下保存。

2. 抗体溶液在小鼠脑内的对流增强递送

注意：根据当地的动物福利法规，可在此操作中使用多种类型的麻醉剂、镇痛剂和抗生素。本方案描述了注射麻醉的使用方法。也可通过在立体定位仪上安装鼻罩来使用吸入性麻醉剂，如异氟烷。此外，我们建议将抗生素加入饮水中以预防感染。

1. 手术准备
   1. 准备麻醉剂和解毒剂溶液。可使用包含芬太尼（0.05 mg/kg）、咪达唑仑（5 mg/kg）和美托咪啶（0.5 mg/kg）的三组分麻醉剂，用无菌蒸馏水（dH₂O）稀释后对小鼠进行安全麻醉。我们采用两步唤醒程序，使用两种解毒剂溶液：第一种包含氟马西尼（0.5 mg/kg）和布托啡诺（0.1 mg/kg），溶于无菌dH₂O中（第一种解毒剂溶液）；第二种包含阿替美唑（2.5 mg/kg），溶于无菌dH₂O中（第二种解毒剂溶液）。
   2. 准备含有卡洛芬（5.667 mg/kg）的镇痛溶液，并用无菌dH₂O稀释。
   3. 清洁立体定位架、加热垫及立体定位机器人各部件。请注意，并非所有机器人部件均可清洁而不造成损坏。具体清洁和使用前准备方法请参考机器人使用手册。
   4. 将逐步导管与注射器组装，并多次用dH₂O、70%乙醇和100%乙醇冲洗，随后再用70%乙醇和dH₂O冲洗。最后用PBS或其他缓冲液（如人工脑脊液）冲洗注射器，以准备用于颅内注射的溶液。注射器活塞在操作过程中应能顺畅自由移动。
   5. 使用立体定位架对立体定位机器人软件进行校准。
   6. 通过确认机器人臂可自由移动、注射泵正确连接，并能无干扰地执行CED程序，来测试立体定位机器人软件。测试内容包括机器人运动、梯度注射、2分钟等待步骤以及导管回撤速度。所有参数应符合第1.3.5点中预设的CED程序。
   7. 将钻头装入钻机中。建议在使用前对钻头进行灭菌处理。
   8. 使用PBS或其他缓冲液（如人工脑脊液，aCSF）配制抗体溶液。单次CED程序可注射5 µL体积中含1至20 µg的抗体。其他体积和蛋白用量应在正式实验前进行测试。请注意，高黏度溶液可能导致导管堵塞。
   9. 手动将稀释后的抗体溶液装入注射器中。
2. 通过CED向纹状体注射抗体
   1. 称量小鼠体重，并根据体重将三组分麻醉剂溶液腹腔注射。记录注射时间。将小鼠转移至配有加热垫的独立笼中。
   2. 观察小鼠以判断镇静是否开始。当小鼠停止活动时，在其眼部涂抹眼膏，以防止手术期间角膜干燥。完全镇静通常在注射三组分麻醉剂后10–15分钟开始。
   3. 使用夹趾反射测试检查疼痛反应，以确认动物已完全麻醉。
   4. 使用毛发修剪器剃除头部毛发。
   5. 用浸有碘溶液的棉签对皮肤进行消毒，以环形方式擦拭三次。
   6. 使用手术刀沿颅骨中线做一条10 mm长的皮肤切口，切口终点位于眼睛水平位置。
   7. 使用鼻夹和耳棒将小鼠固定在立体定位架上。确保颅骨表面水平并牢固固定。除了确保准确的解剖定位外，还必须避免在钻孔和CED过程中颅骨倾斜。
   8. 将注射器安装至立体定位机器人上。
   9. 在参考点处使钻头与导管尖端对齐。在软件中必须精确确定钻头与注射器之间的相对位置，以确保注射可在脑内目标解剖区域进行。
   10. 使用镊子将皮肤拉开，并在颅骨表面定位前囟（bregma）。
   11. 使用钻头尖端在软件中参考定位前囟（bregma）。
   12. 将钻头移至前囟前方1 mm、侧方2 mm处，钻出颅骨孔。注意不要损伤硬脑膜。
   13. 将注射器移至颅骨孔上方。
   14. 从注射器中推出0.5–1 μL液体，以确保导管内无气泡残留。
   15. 启动第1.3.5点所述的CED程序。观察颅骨表面是否有液体从注射部位反流的迹象，并监测动物的呼吸频率。
   16. CED程序结束后，将导管从脑组织中撤出，随即以0.2 µL/min的速度启动注射泵，检查CED过程中是否发生导管堵塞。若未发生堵塞，应立即在导管尖端观察到注射混合液的液滴。
   17. 在重新使用或储存导管前，应在显微镜下目视检查导管阶梯部分是否有任何损伤或磨损，并按照第1.3.10步进行清洁。

结果

图1：粘合剂应用区域的示意图。 将熔融石英管的上端10 mm插入金属针头中。从金属针头尖端开始，沿10 mm长的管段涂抹胶水。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 μL 注射器	Hamilton	7635-01
27 G 钝头针	Hamilton	7762-01
琼脂糖	Promega	V3121
阿替美唑	Janssen
骨蜡	Braun	1029754
丁丙诺啡	Indivior Schweiz AG
卡洛芬	Pfizer AG
牙科钻头，钢制，ISO 009 规格	Hager & Meisinger	1RF009
100% 乙醇	Reuss-Chemie AG	179-VL03K-/1
芬太尼	Helvepharm AG
异硫氰酸荧光素标记葡聚糖，2000 kDa	Sigma Aldrich	FD2000S
氟马西尼	Labatec Pharma AG
甲醛	Sigma Aldrich	F8775-500ML
高黏度氰基丙烯酸酯胶水	Migros
碘溶液	Mundipharma
美托咪啶	Orion Pharma AG
微电极拉制仪	Narishige	MF-900
咪达唑仑	Roche Pharma AG
眼科软膏	Bausch + Lomb	Vitamin A Blache
PBS	ThermoFischer Scientific	10010023
与 Alexa Fluor 647 偶联的多克隆山羊抗大鼠 IgG (H+L) 抗体	Jackson Immuno
手术刀	Braun	BB518
石英毛细管，内径 0.1 mm，壁厚 0.0325 mm	Postnova	Z-FSS-100165
小鼠立体定位仪	Stoelting	51615
立体定位机器人	Neurostar	Drill and Injection Robot
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389-500G
外用组织粘合剂	Zoetis	GLUture
台盼蓝	ThermoFischer Scientific	15250061
水	Bichsel	1000004