对流增强抗体向小鼠大脑的递送

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 阶梯导管的制备

1. 为导管步骤准备熔融石英管
   1. 将内径为 0.1 mm、壁厚为 0.0325 mm 的熔融石英毛细管切割成 30 mm 的长度。
   2. 检查管子是否有裂纹，并使用微锻造技术对末端进行热抛光，以确保管子开口具有光滑的表面。
将
2. 内管固定在金属针中
   1. 将 27 G 针头安装在 10 μL 注射器上，并将注射器放入立体定向机器人中。
   2. 使用机器人，将注射器移动到坚硬的表面上，然后用针尖接触它。这个位置应该记下或保存在软件中，因为它将用作设置导管步骤长度的参考表面。
   3. 抬高针头，使熔融石英毛细管能够放置在针头内部。
   4. 将熔融石英毛细管放入针中，使 20 mm 的毛细管从针头中伸出。
   5. 使用移液管，将 2 μL 高粘度氰基丙烯酸酯胶粘剂均匀涂抹在毛细管上，从金属针开始，在毛细管下端上方 10 mm 处结束，如图 1 所示。
   6. 使用立体定向机器人，降低针头，直到金属针的尖端在参考表面上 1 毫米。这样，熔融石英毛细管将固定在金属针中，从尖端形成 1 mm 的台阶。去除金属针末端形成的多余胶水，以避免使步骤变钝。
   7. 等待 15 分钟让胶水变硬，然后从立体定向机器人上取下带有导管的注射器。通过在显微镜下检查导管的尖端，确认在步骤中已去除所有多余的胶水。
3. 使用琼脂糖块测试阶梯导管
   1. 在常规凝胶托盘中的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 0.6% 琼脂糖溶液，并等待其聚合。将琼脂糖切成大约 20 mm x 20 mm 的块。使用前，请将块浸入 PBS 中。
   2. 手动用 10 μL 0.4% 过滤台盼蓝溶液填充阶梯导管注射器。
   3. 使用立体定向机器人，以 0.2 μL/min 的速度分配 1 μL，以评估固定过程中导管步骤的密封性。台盼蓝溶液应仅在导管尖端可见。用纸巾擦掉。
   4. 将琼脂糖块放入立体定向机器人中并校准机器人，使导管的尖端参考琼脂糖块的表面。
   5. 对 CED 的注射参数进行编程。
      1. 对于 5 μL 的进样体积，请使用以下步骤:1 μL （0.2 μL/min），然后 2 μL （0.5 μL/min） 和 2 μL （0.8 μL/min）。
      2. 要将溶液注射到鼠尾状壳核（纹状体）中，请在距离前囟 1.5 毫米的正面和 1.5-2 毫米的侧面位置进行此类注射，深度为 3.5 毫米。
      3. 注射后，将导管留在原位 2 分钟，然后以 1 mm/min 的速度缩回，以确保液体在大脑中适当分散，并在导管移除过程中密封注射道><。 注意:所有参数都可以编程到单个脚本中，具体取决于特定的立体定向机器人。
   6. 启动 CED 程序，将 5 μL 台盼蓝溶液注入琼脂糖块中。
   7. 评估琼脂糖中台盼蓝云的形状和沿导管道的潜在渗漏。台盼蓝应形成椭球体或圆形云，中心围绕导管尖端，直径至少为 1 毫米。不应看到金属针尖端的主要回流。
   8. 放置新的琼脂糖模块，以 0.2 μL/min 的速度开始第二次注射 1 μL，以评估导管是否被琼脂糖堵塞。台盼蓝应在注射开始后立即开始从导管尖端形成云状物。
   9. 评估注射器中的剩余体积是否对应于 3 μL。任何变化都可能表明液体通过导管支架或注射器柱塞泄漏。
   10. 如果所有测试注射都成功，导管密封良好且笔直，并且从导管尖端以外的其他位置没有观察到台盼蓝溶液，用去离子 H₂O （dH₂O） 清洗导管，直到看不到台盼蓝的痕迹，然后按如下方式洗涤十次:70% 乙醇和 100% 乙醇，然后再次用 70% 乙醇和干净的去离子水冲洗。
   11. 将导管存放在干燥的条件下。

2. 抗体溶液对流增强递送到小鼠大脑

注意:根据当地的动物福利法规，可以为此程序使用各种类型的麻醉剂、镇痛药和抗生素。该协议描述了注射麻醉的使用。吸入麻醉剂（如异氟醚）也可以通过在立体定向框架上安装鼻罩来使用。此外，我们建议在饮用水中添加抗生素以预防感染。

1. 手术设置
   1. 准备麻醉剂和解毒剂。可以使用含有芬太尼 （0.05 mg/kg）、咪达唑仑 （5 mg/kg） 和美托咪定 （0.5 mg/kg） 的三组分麻醉剂安全地麻醉小鼠，并在无菌蒸馏水 （dH₂O） 中稀释。我们使用两种解毒剂溶液进行两步唤醒程序，其中一种在无菌 dH₂O（第一解毒剂溶液）中含有氟马西尼 （0.5 mg/kg） 和丁丙诺啡 （0.1 mg/kg）。第二个在无菌 dH₂O（第二解毒剂溶液）中含有阿替美唑 （2.5 mg/kg）。
   2. 制备含有用无菌 dH₂O 稀释的卡洛芬 （5.667 mg/kg） 的镇痛溶液。
   3. 清洁立体定向框架、加热垫和立体定向机器人的元件。请记住，并非所有机器人部件都可以在没有损坏风险的情况下进行清洁。有关清洁和使用准备的详细信息，请参阅机器人手册。
   4. 将注射器与阶梯导管组装在一起，并用 dH₂O、70% 乙醇和 100% 乙醇多次冲洗，然后再次用 70% 乙醇和 dH₂O 冲洗。最后，用 PBS 或其他缓冲液冲洗注射器，以制备颅内注射溶液，例如人工脑脊液。注射器柱塞在手术过程中应平稳自由地移动。
   5. 使用立体定向框架校准立体定向机器人软件。
   6. 通过确保机器人手臂自由移动、注射泵正确连接以及它可以在没有任何干扰的情况下执行 CED 程序来测试立体定向机器人软件。这包括测试机器人运动、斜坡注射、检查 2 分钟等待步骤以及检查导管缩回的速度。所有参数都应符合第 1.3.5 点中描述的预编程 CED 程序。
   7. 将钻头插入钻头。建议在使用前对钻头进行消毒。
   8. 使用 PBS 或其他缓冲溶液（如人工脑脊液 （aCSF））制备抗体溶液。可在单个 CED 程序中注射 5 μL 中的 1 至 20 μg 抗体。在进行实验之前，应测试其他体积和蛋白质量。请注意，使用高粘度溶液可能会导致导管堵塞。
   9. 手动将稀释的抗体加载到注射器中。
2. 通过 CED 将抗体注射到纹状体中
   1. 称量小鼠，根据体重将三组分麻醉液注射到腹膜中。注意注射时间。将鼠标转移到用加热垫加热的单独笼子中。
   2. 观察鼠标以确定镇静何时开始。当鼠标停止移动时，在眼睛上涂抹眼药膏，以保护角膜在手术过程中不会干燥。完全镇静通常在注射三组分麻醉溶液后 10-15 分钟开始。
   3. 使用捏反射测试检查疼痛反应，以确保动物完全麻醉。
   4. 使用头发修剪器剃光头。
   5. 用蘸有碘溶液的棉签对皮肤进行消毒。以打圈的方式擦洗皮肤 3 次。
   6. 沿颅中线做一个 10 毫米的皮肤切口，用手术刀在眼睛水平完成。
   7. 使用鼻夹和耳杆将鼠标固定在立体定向框架中。确保颅骨表面水平并牢固固定。除了正确的解剖导航外，在钻孔和 CED 过程中避免颅骨倾斜也很重要。
   8. 将注射器放入立体定向机器人中。
   将
   9. 钻头与参考点上的导管尖端同步。必须在软件中精确确定钻头和注射器位置之间的关系，以便可以在大脑的所需解剖区域进行注射。
   10. 使用镊子缩回皮肤，并将前囟定位在颅骨表面。
   11. 使用钻头尖端在软件中引用 Bregma。
   12. 将钻头移动到距前囟 1 毫米正面和 2 毫米横向的位置，并钻一个毛刺孔。小心不要损坏硬脑膜。
   13. 将注射器移到毛刺孔上。
   14. 从注射器中分配 0.5–1 μL，以确保导管中没有气泡。
   15. 启动第 1.3.5 点中描述的 CED 程序。观察颅骨表面是否有液体从注射点回流的痕迹。监测动物的呼吸频率。
   16. 一旦 CED 程序结束并且导管从大脑中取出，以 0.2 μL/min 的速度启动注射泵，以检查 CED 期间导管是否堵塞。如果没有发生堵塞，您应该立即从导管尖端看到一滴注射混合物。
   17. 在重复使用或存放导管之前，请在显微镜下目视检查导管步骤是否有任何损坏或磨损的迹象，并按照步骤 1.3.10 进行清洁。

图 1:描述胶粘剂应用领域的示意图。将熔融石英管的上部 10 mm 插入金属针中。从金属针的尖端开始，将胶水涂抹在 10 mm 管上。