一种基于细胞的检测方法用于评估小胶质细胞对Tau蛋白的摄取

摘要

来源：De Marco, D. 等，利用细胞实验研究小胶质细胞介导的抗体清除Tau蛋白的方法 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种基于细胞的检测方法，该方法利用pH敏感的荧光标记Tau蛋白聚集体，通过荧光激活细胞分选技术定量分析小鼠小胶质细胞对Tau蛋白的摄取。

方案

1. BV-2 小胶质细胞培养

注意：在生物安全二级防护条件下操作 BV-2 细胞。BV-2 细胞系可产生一种包膜型重组嗜鼠性逆转录病毒（仅能感染小鼠细胞）；此类病毒以其 in vitro 体外转化能力和 in vivo 体内致瘤潜能而著称。

1. 将BV-2细胞接种于高糖 Dulbecco 改良必需培养基（DMEM）中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（此后简称培养基），接种密度为4 x 10⁴ 个细胞/mL。
2. 将细胞置于37 °C、含5% CO₂ 的湿润环境中培养。
   注意：细胞呈松散贴壁和悬浮生长状态。

2. 使用pH敏感型荧光染料标记重组Tau蛋白聚集体

注意： Tau 聚集体的制备方法如 Apetri 等 所述，不同之处在于反应缓冲液中未添加硫磺素T（ThT）。聚集后的样品收集于1.5 mL离心管中。通过将118 µL样品与12 µL的50 µM ThT溶液混合，检测最终荧光信号。通过在4 °C下以20,000 × g 离心1小时，使聚集体从反应混合物中分离。上清液通过SEC-MALS分析，以确认所有单体Tau均已转化为聚集体。沉淀物（Tau聚集体）迅速冷冻，并储存在-80 °C冰箱中。

1. 用 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液（NaHCO₃）重悬 tau 聚集体₃在 pH 8.5 条件下，浓度为 1 mg/mL（约 20 µM）。        
   注意： tau 聚集体的浓度基于单体初始浓度，通过在 280 nm 处测定 tau 单体的吸光度，并利用 0.31 mL·mg⁻¹·cm⁻¹ 的消光系数确定。^-1cm^-1.
2. 将重悬的聚集体置于冰上，使用探头式超声波破碎仪进行超声处理，以避免过热。
   1. 使用65%的振幅（超声波破碎仪功率为250 W）。
   2. 进行8次脉冲，每次3秒，脉冲间隔15秒，以避免过热。
3. 制备8.9 mM的pH敏感型 染料（下文简称pH染料）溶于二甲基亚砜（DMSO），具体操作按制造商说明进行。
   注意： 每次均需配制新鲜溶液，且仅限配制当天使用。
4. 每摩尔蛋白质加入10摩尔染料，使染料终浓度为0.2 mM。
5. 通过轻柔地上下吹打混匀。
6. 将反应混合物在室温下避光孵育45–60分钟。
7. 同时，按照制造商说明书组装交联葡聚糖凝胶脱盐柱。
8. 用 25 mL 0.1 M NaHCO₃ 平衡色谱柱₃ 缓冲液 pH 8.5 含有 3% DMSO。弃去流穿液。
9. 将tau聚集体标记反应的产物加入柱中，总体积为2.5 mL。如果样品体积小于2.5 mL，需加入缓冲液至总体积达到2.5 mL。
10. 让样品完全进入凝胶柱，弃去流出液。
11. 用3.5 mL 0.1 M NaHCO₃洗脱₃ 含3% DMSO的pH 8.5缓冲液 并用2 mL离心管收集洗脱液，分为等量的4份。
12. 采用二辛可宁酸（BCA）法测定4个组分的蛋白质浓度。
13. 将标记好的蛋白质储存在 -20 °C 冰箱中。

3. 基于荧光激活细胞分选（FACS）检测的摄取实验

1. 第1天 – 接种细胞
   1. 用1×洗涤液洗涤BV-2细胞，先移除培养瓶中的培养基，再加入1×洗涤液 磷酸盐缓冲液（PBS）    
      注意： 洗涤体积需根据所用细胞培养瓶的大小进行调整。例如，对于T175培养瓶，使用10 mL的1x PBS进行洗涤。
   2. 从培养瓶中移除 PBS，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下用 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）孵育以解离细胞₂ 直到细胞从培养瓶脱落（约5分钟）。  
      注意： 胰蛋白酶-EDTA 0.05% 的使用体积取决于所用细胞培养瓶的大小。例如，对于 T175 培养瓶，使用 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 0.05%。
   3. 用移液器将细胞在培养基中上下吹打三至五次，重悬细胞。
      注意： 培养基的体积根据所用细胞培养瓶的大小以及瓶内细胞的总数而定。例如，对于T175培养瓶，使用8 mL培养基。
   4. 计数细胞并制备细胞悬液 1 × 10 的最终浓度⁵ 细胞/mL，置于含200 μg/mL肝素的培养基中。
   5. 将250 µL细胞悬液（2.5 × 10⁵ 个细胞）接种于⁴ 每孔96孔平底组织培养板中的细胞数
   6. 37 °C 下孵育平板过夜，并 5% CO₂.
2. 第1天——制备免疫复合物
   1. 将pH染料-tau置于冰上解冻。
   2. 每种条件下，用无血清培养基（高糖 DMEM，添加 100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素和 200 µg/mL 肝素）配制 65 μl 的 500 nM pH 染料-tau 聚集体溶液。
   3. 在65 µl SFM中配制抗体稀释液，浓度为最终浓度的两倍。在96孔圆底板中混合pH染料-tau聚集体与抗体。每种条件的终体积为130 µl，pH染料-tau聚集体浓度为250 nM。 密封稀释平板，于37 °C过夜培养。
3. 第2天——免疫复合物摄取
   1. 从 BV-2 细胞中移除培养基，用 100 µL 室温 1x PBS 洗涤细胞一次。
   2. 使用多通道移液器将125 µL免疫复合物转移至细胞中。将细胞与免疫复合物共同孵育2小时。 在 37 °C 下 5% CO₂.
   3. 从细胞中移除培养液并弃去。用100 µL室温1x PBS洗涤细胞一次。
   4. 吸除 1x PBS，加入 50 µL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，37 °C 下处理 20 min 5% CO_2.
   5. 加入 200 µL 培养基，通过上下吹打充分重悬细胞以使其脱离。将细胞转移至 96 孔圆底板中。以 400 x g 4 °C下离心5分钟。
   6. 将培养板置于冰上，吸除培养基，然后用150 µL预冷的1×PBS重悬细胞沉淀，洗涤细胞两次。400 × g离心培养板 g 4 °C 下离心 5 分钟。
   7. 将细胞置于冰上，移除加入的1×PBS，用150 µL冷FACS缓冲液（1×PBS、0.5%牛血清白蛋白（BSA）、2 mM EDTA）重悬细胞沉淀进行洗涤。在400 × g条件下离心平板 g 4 °C下离心5分钟。
   8. 将细胞置于冰上，去除添加的FACS缓冲液，并重悬细胞 在200 µL冷FACS缓冲液中。
   9. 立即通过FACS分析样本，采集2 x 10⁵个细胞⁴ 活细胞门控中的事件（参见步骤 4.1）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BV-2 细胞	ICLC 细胞库	ATL03001
磷酸盐缓冲液 (PBS) (1X)	Gibco	10010-015
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
DMEM 4.5 g/dl 葡萄糖	Gibco	41966-029
胎牛血清	Gibco	10091-148
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
200 mM L-谷氨酰胺	Lonza	17-605E
EasYFlask	Nunc	156499 / 159910
pHrodo Green STP 酯	Life Technologies	P35369
100 mM 碳酸氢钠，pH 8.5
DMSO	Sigma	D2650-100ml
PD10 柱	GE Healthcare	17-0851-01
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225
Greiner CELLSTAR 多孔培养板	Greiner	665180
Falcon 96 孔检测板	Falcon	353910
肝素	Sigma	H3393-50KU
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Sigma	T4049-100ml
BSA	Sigma	A7030-100G
0.5 M EDTA，pH 8