一种基于细胞的测定法，用于评估小胶质细胞对 tau 蛋白的摄取

1. BV-2 小胶质细胞培养

注意:处理生物安全 2 级防护下的 BV-2 细胞。BV-2 细胞系产生包膜重组嗜亲逆转录病毒（仅能够感染小鼠细胞）;此类病毒以其体外转化能力和体内致瘤潜力而闻名。

1. 在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺（从现在开始称为培养基）的高葡萄糖 Dulbecco 改良 eagle 培养基 （DMEM） 中培养 BV-2 细胞，以 4 x 10⁴ 个细胞/mL 的密度接种细胞。
2. 将培养物维持在 37 °C 的 5% CO₂ 潮湿环境中><。 注意:细胞松散附着并处于悬浮状态。

2. 用 pH 敏感荧光染料标记重组 Tau 聚集体

注意:按照 Apetri 等人的描述制备 Tau 聚集体。不同之处在于，反应缓冲液中未添加硫黄素 T （ThT）。将聚集的样品收集在 1.5 mL 离心管中。将 118 μL 混合样品与 12 μL 50 μM ThT 溶液混合，检查最终荧光信号。通过在 4 °C 下以 20,000 x g 离心聚集体反应混合物 1 小时来分离聚集体。通过 SEC-MALS 分析上清液，以确认所有单体 tau 都转化为聚集体。将沉淀（tau 聚集体）快速冷冻并储存在 -80 °C 的冰箱中。

1. 在 pH 值为 8.5 的 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液 （NaHCO₃） 中重悬 tau 聚集体至浓度为 1 mg/mL （~ 20 μM）。
   注意:tau 聚集体的浓度基于初始单体浓度，通过使用 0.31 ^{mLmg-1 cm-1} 的消光系数在 280 nm 处吸收 tau 单体来评估。
2. 使用探针超声仪对重悬的聚集体进行超声处理，同时将它们保持在冰上以避免过热。
   1. 使用 65% 的振幅（使用功率为 250 W 的超声仪）。
   2. 执行 8 个 3 秒的脉冲，脉冲之间暂停 15 秒，以避免过热。
3. 按照制造商的说明，在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 8.9 mM pH 敏感染料（以下简称 pH 染料）储备液><。 注意:始终准备新鲜的溶液，并仅在准备好的当天使用。
4. 每摩尔蛋白质加入 10 摩尔染料，使最终染料浓度为 0.2 mM。
5. 轻轻上下移液混合。
6. 在室温下避光孵育反应混合物 45–60 分钟。
7. 同时，按照制造商的说明组装交联葡聚糖凝胶脱盐柱。
8. 用 25 mL 含 3% DMSO 的 0.1 M NaHCO₃ 缓冲液 pH 8.5 平衡色谱柱。丢弃流出。
9. 将 tau 聚集体标记反应的产物以 2.5 mL 的总体积添加到色谱柱中。如果样品少于 2.5 mL，则添加缓冲液直至总体积达到 2.5 mL。
10. 让样品完全进入填充的凝胶，弃去流出液。
11. 用 3.5 mL 含 3% DMSO 的 0.1 M NaHCO₃ 缓冲液 pH 8.5 洗脱，并将洗脱液分成 4 个等效馏分收集在 2 mL 管中。
12. 通过二辛可宁酸 （BCA） 测定法测定 4 个级分的蛋白质浓度。
13. 将标记的蛋白质储存在 -20 °C 冰箱中。

3. 使用荧光激活细胞分选 （FACS） 读数的摄取测定

1. 第 1 天 – 细胞种子
   1. 通过去除培养基并加入 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 在培养瓶中洗涤 BV-2 细胞。
      注意:洗涤体积将根据所用细胞培养瓶的大小而变化。例如，对于 T175 培养瓶，用 10 mL 的 1x PBS 洗涤。
   2. 从培养瓶中取出 PBS，并通过在 37 °C 和 5% CO₂ 下与 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA） 孵育来分离细胞，直到细胞从培养瓶中分离（约 5 分钟）。
      注意:胰蛋白酶-EDTA 0.05% 的体积取决于所用细胞培养瓶的大小。例如，对于 T175 培养瓶，使用 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 0.05%。
   3. 通过上下吹打 3 到 5 次，将细胞重悬于培养基中。
      注:培养基的体积根据所用细胞培养瓶的大小而变化，因此培养瓶中的细胞总数也不同。例如，对于 T175 培养瓶，使用 8 mL 培养基。
   4. 在含有 200 μg/mL 肝素的培养基中对细胞进行计数并制备终浓度为 1 x 10⁵ 个细胞/mL 的细胞悬液。
   5. 将 250 μL 细胞悬液（2.5 x 10⁴ 个细胞）接种在 96 孔组织培养平底板中。
   6. 将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育过夜。
2. 第 1 天 – 准备免疫复合物
   1. 在冰上解冻 pH 染料-tau。
   2. 在无血清培养基 （SFM）（补充有 100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 200 μg/mL 肝素的高葡萄糖 DMEM）中，每个条件制备 65 μl 500 nM pH 染料-tau 聚集体溶液。
   3. 在 65 μl SFM 中制备抗体稀释液，浓度为最终浓度的两倍。在 96 孔 U 形底板中混合 pH 染料-tau 聚集体和抗体。每个条件的最终体积现在为 130 μl，pH 染料-tau 聚集体浓度为 250 nM。密封稀释板并在 37 °C 下孵育过夜。
3. 第 2 天 – 免疫复合物摄取
   1. 从 BV-2 细胞中取出培养基。用 100 μL 室温 1x PBS 洗涤细胞一次。
   2. 使用多通道移液器将 125 μL 免疫复合物转移到细胞中。将细胞与免疫复合物在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 2 小时。
   3. 从细胞中取出孵育培养基并丢弃。用 100 μL 室温 1x PBS 洗涤细胞一次。
   4. 去除 1x PBS，并在 37 °C 和 5% CO 2 下用 50 μL 胰蛋白酶-EDTA 0.25% 处理细胞 20 分钟_。
   5. 加入 200 μL 培养培养基，并通过上下吹打以分离细胞来充分重悬。将细胞转移到 96 孔 U 形底板中。在 4 °C 下以 400 x g 离心板 5 分钟。
   6. 将板放在冰上，去除培养基，并将细胞沉淀重悬于 150 μL 冰冷的 1x PBS 中，洗涤细胞两次。在 4 °C 下以 400 x g 离心板 5 分钟。
   7. 将细胞放在冰上，除去添加的 1x PBS，并通过在 150 μL 冷 FACS 缓冲液（1x PBS、0.5% 牛血清白蛋白 （BSA）、2 mM EDTA）中重悬细胞沉淀来洗涤它们。在 4 °C 下以 400 x g 离心板 5 分钟。
   8. 将细胞置于冰上，去除添加的 FACS 缓冲液，并将细胞重悬于 200 μL 冷 FACS 缓冲液中。
   9. 通过 FACS 在活细胞门中获取 2 x 10⁴ 个事件立即分析样品（参见步骤 4.1）。