一种纯化中国仓鼠卵巢细胞产生的单克隆抗体的技术

摘要

来源：Velugula-Yellela, S. R.，等。利用自动化微型生物反应器系统从中国仓鼠卵巢细胞中纯化和分析单克隆抗体。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种从中国仓鼠卵巢细胞收获的细胞培养液中纯化单克隆抗体的实验方法。该方法采用固定化蛋白A的多孔玻璃树脂，蛋白A可特异性结合样品中抗体的Fc区，从而有效将其与杂质分离。通过低pH洗脱缓冲液减弱蛋白A与抗体之间的相互作用，进而实现纯化抗体的回收。

方案

1. 抗体的纯化

注意：自制抗体的平衡缓冲液为 25 mM Tris、100 mM NaCl，pH 7.5。洗脱缓冲液使用 0.1 M 乙酸。缓冲液和树脂（Protein A）的选择取决于具体纯化的抗体。柱体积相当于树脂的床高度。流动相的使用量以柱体积为单位确定。

1. 启动纯化系统
   1. 打开与纯化系统连接的软件。根据手动操作说明，以 2 mL/min 的流速用平衡缓冲液平衡层析柱 40 分钟。平衡完成后停止手动运行。
   2. 在馏分收集器中放置 15 mL 圆锥管用于收集纯化的抗体洗脱液，以及 50 mL 圆锥管用于在高盐洗涤期间收集穿流液。确保在运行开始前打开并关闭馏分收集器，使其重置至起始位置。馏分收集器维持在 7 °C。
      注意：可在 设置 菜单下的 馏分收集器 选项卡中手动重置馏分收集器，适用于 15 mL 和 50 mL 管。
2. 样品注入
   注意：后续步骤中使用的收获细胞培养液来自在自动微型生物反应器中培养的中国仓鼠卵巢细胞。
   1. 将经 0.22 µm 滤膜过滤的收获细胞培养液加入一个喷嘴端已封帽的空 12 mL 注射器中。
   2. 握住注射器使喷嘴朝下，插入活塞直至其一小部分进入注射器内。确认液体无泄漏后，将注射器旋转至喷嘴朝上并取下封帽。
   3. 继续保持喷嘴朝上，推动活塞排出所有气泡，直至细胞培养液到达喷嘴尖端。将注射器喷嘴插入纯化系统的手动进样口并旋转固定。
   4. 下压活塞，直至所有样品完全注入，并可在连接的 10 mL 大体积样品环中观察到样品。
   5. 打开已保存的方法文件。在提示时保存结果文件至指定位置并命名文件。在样品注入大体积样品环后，点击 运行。
3. 运行纯化方法
   1. 选择已保存的方法，当仪器软件提示时点击运行（步骤 1.2.5）。
      注意：系统已设定自动执行以下步骤。仪器运行期间用户无需进行任何操作。
   2. 以 2 mL/min 的流速用三倍柱体积（CV）的平衡缓冲液平衡层析柱。柱平衡完成后，系统将通过大体积样品环以 1 mL/min 的流速将样品上样至层析柱。
   3. 280 nm 处的紫外信号下降表明样品上样完成。以 2 mL/min 的流速用平衡缓冲液洗涤层析柱，直至紫外信号降至 25 mAU 以下。
   4. 使用 pH 7.5 的 25 mM Tris 缓冲液含 1 M NaCl，以四倍柱体积（CV）和 2 mL/min 的流速进行二次高盐洗涤。系统馏分收集器将把盐洗过程中从柱上洗脱的任何蛋白/DNA 收集至 50 mL 管中。
   5. 以 1 mL/min 的流速施加五倍柱体积（CV）的洗脱缓冲液，将抗体从柱上洗脱。根据紫外信号收集洗脱液：当 280 nm 紫外信号高于 35 mAU 时开始收集，信号降至 50 mAU 以下时停止收集；此过程称为峰切割。
      注意：峰切割可确保洗脱曲线的标准化，并避免可能含有蛋白聚集体的峰拖尾部分。
   6. 使用三倍柱体积（CV）的平衡缓冲液洗涤层析柱。洗涤步骤完成后运行结束。
   7. 洗脱后立即使用 1 M Tris 碱将纯化蛋白中和至 pH 约 5.5。使用微量紫外-可见分光光度计在 280 nm 和 260 nm 处测定蛋白浓度，并将样品储存在 4 °C。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CHO DG44 细胞系	Invitrogen	A1100001
Akta Avant 25	通用电气生命科学	28930842
Pro Sep vA Ultra 层析树脂	Millipore Sigma	115115830	纯化固定相
Omnifit 10 cm 柱	Diba Fluid Intelligence	006EZ-06-10-AA	固定相柱管
Tris 碱	费舍尔科技	BP154-1
Superloop 10 mL	GE 医疗	18-1113-81
µDawn 多角度激光散射检测器	Wyatt	WUDAWN-01
0.22 µm Millex GV 滤器单元 PVDF 膜	默克密理博	SLGV033RB
10X 磷酸盐缓冲液	康宁	46-013-CM
12 mL 注射器	Covidien	8881512878
50 mL Falcon 管	康宁公司	352070
96 孔板	Bio-Rad	127737
乙酸	Sigma-Aldrich	695072
Amicon Ultra-4 100 kDa 离心滤器	默克密理博	UFC810096
氨基酸标准品，1 nmol/µL	安捷伦科技	5061-3330
氨基酸补充剂	安捷伦科技	5062-2478
甲酸铵溶液 - 糖链分析	沃特世公司	186007081
蓝色螺帽带隔垫	安捷伦科技	5182-0717
色谱用水（质谱级）	费舍尔化学	W6-4
盐酸	费舍尔科技	A144-500
完整单克隆抗体质量校准标准品	沃特世公司	186006552
Intrada 氨基酸柱 150 x 2 mm	Imtakt	WAA25
NanoDrop One 微体积紫外-可见分光光度计	赛默飞世尔科技	840274100